miR-374a-3p靶向Syk對ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)的影響

馮自波 祝友鵬 張靜

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的屏障，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1］。研究發(fā)現(xiàn)miRNA 參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能［2］。氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中miR-374a 下調(diào)表達(dá)［3］。miR-374a 可通過抑制氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡來保護(hù)PC12 細(xì)胞免受缺氧性損傷［4］。miR-374a 可保護(hù)小鼠免于心肌缺血/再灌注損傷［5］。脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）是一種非受體型酪氨酸激酶，與血管內(nèi)皮功能及炎癥反應(yīng)有關(guān)［6］。抑制Syk 表達(dá)可降低小鼠炎癥反應(yīng)和動脈粥樣硬化［7］。然而miR-374a-3p 和Syk 對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制尚不清楚，本實驗通過用ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC 建立氧化損傷模型，研究miR-374a-3p 和Syk 對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC 損傷及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）購自美國菌種保藏中心；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、ox-LDL 購自美國Sigma公司；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒、熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen 公司；二辛可寧酸（BCA）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體均購自上海煊翎生物科技有限公司；載體質(zhì)粒購自上?；偕锟萍加邢薰?；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37℃、5%CO2下培養(yǎng)HUVEC，2 d 換液一次，用終濃度為50 μg/mL 的ox-LDL 培養(yǎng)HUVEC 細(xì)胞48 h，作為ox-LDL 處理組，正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照（Con）組。將miR-NC、miR-374a-3p、anti-miR-NC、antimiR-374a-3p 轉(zhuǎn)染至HUVEC 中，分別記為miR-NC組、miR-374a-3p 組、anti-miR-NC 組、anti-miR-374a-3p 組；將miR-NC、miR-374a-3p、si-NC、si-Syk 轉(zhuǎn)染至HUVEC 后再用50 μg/mL 的ox-LDL 處理，記為ox-LDL+miR-NC 組、ox-LDL+miR-374a-3p 組、ox-LDL+si-NC 組、ox-LDL+si-Syk 組；將miR-374a-3p 與pcDNA3.1、pcDNA3.1-Syk分別共轉(zhuǎn)染至HUVEC 后再用50 μg/mL的ox-LDL處理，記為ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1 組、ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1-Syk 組；轉(zhuǎn)染均按照LipofectamineTM2000 試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-374a-3p 表達(dá)水平

細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，循環(huán)條件為95℃30 s，60℃30 s；72℃30 s，共40 個 循環(huán)；72℃延 長5 min。相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。miR-374a-3p以U6 為內(nèi)參，miR-374a-3p 上游引物序列：5′-TACATCGGCCATTATAATA-3′，下游引物序列：5′-TACACAGAATTACAATAC-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）檢測Syk、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE 轉(zhuǎn)至PVDF上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗膜；加入二抗室溫孵育90 min，TBST 洗滌3 次，用ECL 化學(xué)發(fā)光液顯像，用Quantity One 凝膠軟件測定各組蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。每個蛋白樣品設(shè)3 個重復(fù)。

1.2.4 MTT 試劑盒檢測細(xì)胞活性

各組細(xì)胞培養(yǎng)至24、48、72 h 時分別加入20 μL 的MTT 溶液，37℃孵育4 h；每孔加入150 μL DMSO 后振蕩反應(yīng)15 min，酶標(biāo)儀于490 nm 波長處檢測各孔吸光度（OD）值。細(xì)胞活性（%）=實驗組OD 值/空白對照組OD 值×100%。實驗重復(fù)3次，每次設(shè)3 個復(fù)孔。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后用PBS 漂洗2 次，重懸細(xì)胞，按照試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC 和PI 避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。實驗重復(fù)3 次，每次設(shè)3 個復(fù)孔。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測TNF-α、IL-1β、IL-6 含量水平

各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h 后離心取上清，具體按照按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.2.7 熒光素酶報告實驗檢測miR-374a-3p 對Syk 的靶向調(diào)控

構(gòu)建Syk 野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-Syk 和MUT-Syk，用LipofectamineTM2000 將WT-Syk和MUT-Syk分別與miR-NC和miR-374a-3p轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。按照說明書要求，進(jìn)行雙熒光素酶報告實驗檢測。實驗重復(fù)3 次。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.00 進(jìn)行分析。計量資料以（）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-374a-3p、Syk 在ox-LDL 作用的HUVEC中的表達(dá)

與對照組相比，ox-LDL 作用的HUVEC 中miR-374a-3p 表達(dá)水平顯著降低，Syk 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）（圖1，表1）。

圖1 Syk 蛋白的表達(dá)Figure 1 Expression of Syk protein

表1 miR-374a-3p 在ox-LDL 作用的HUVEC 中的表達(dá)［n，（±s）］Table 1 Expression of miR-374a-3p in HUVECs treated with ox-LDL［n，（±s）］

表1 miR-374a-3p 在ox-LDL 作用的HUVEC 中的表達(dá)［n，（±s）］Table 1 Expression of miR-374a-3p in HUVECs treated with ox-LDL［n，（±s）］

注：與Con 組比較，a P＜0.05。

分組Con ox-LDL t 值P 值n9 9 miR-374a-3p 1.00±0.10 0.26±0.03a 21.264 0.000

2.2 過表達(dá)miR-374a-3p 對ox-LDL 作用的HUVEC 損傷及炎癥反應(yīng)的影響

與對照組相比，ox-LDL 作用的HUVEC 中miR-374a-3p 表達(dá)水平顯著降低，Bax 表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，TNF-α、IL-6 含量顯著升高（P＜0.05）；與ox-LDL+miR-NC 組相比，ox-LDL+miR-374a-3p 組HUVEC 中miR-374a-3p 表達(dá)水平顯著升高，Bax 表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，TNF-α、IL-6 含量顯著降低（P＜0.05）（圖2，表2）。

圖2 過表達(dá)miR-374a-3p 對ox-LDL 作用的HUVEC凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of overexpression of mir-374a-3p on HUVEC apoptosis and expression of apoptotic protein by ox LDL

表2 過表達(dá)miR-374a-3p 對ox-LDL 作用的HUVEC 活性、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響［n=9，（±s）］Table 2 Effect of overexpression of mir-374a-3p on HUVEC activity，apoptosis and inflammatory response induced by ox LDL［n=9，（±s）］

表2 過表達(dá)miR-374a-3p 對ox-LDL 作用的HUVEC 活性、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響［n=9，（±s）］Table 2 Effect of overexpression of mir-374a-3p on HUVEC activity，apoptosis and inflammatory response induced by ox LDL［n=9，（±s）］

注：與Con 組比較，a P＜0.05；與ox-LDL+miR-NC 組比較，b P＜0.05。

分組Con ox-LDL ox-LDL+miR-NC ox-LDL+miR-374a-3p F 值P 值細(xì)胞活性（490 nm）24 h 0.61±0.06 0.24±0.02a 0.25±0.02 0.48±0.05b 171.304 0.000 48 h 0.98±0.10 0.37±0.04a 0.38±0.04 0.73±0.07b 173.503 0.000 72 h 1.46±0.15 0.56±0.05a 0.58±0.06 1.16±0.12b 165.433 0.000凋亡率7.52±0.83 26.61±2.74a 25.99±2.61 12.26±1.30b 201.728 0.000 miR-374a-3p 1.02±0.10 0.28±0.03a 0.27±0.03 0.81±0.08b 317.934 0.000 TNF-α 443.54±59.28 1762.27±156.61a 1705.68±161.28 686.53±75.82b 280.440 0.000 IL-6 75.51±11.58 415.69±38.89a 407.68±39.15 112.16±14.26b 360.902 0.000

2.3 miR-374a-3p 靶向、調(diào)控Syk

通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到Syk 與miR-374a-3p 存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。熒光素酶報告實驗結(jié)果（表3）顯示，相較于miR-NC 組，miR-374a-3p 組WT-Syk 的HUVEC 熒光素酶活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而MUT-Syk 的HUVEC 熒光素酶活性差異不顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Western Blot 檢測結(jié)果（圖3B）顯示，相較于miR-NC 組，miR-374a-3p 組Syk 表達(dá)水平顯著降低；而相較于anti-miR-NC 組，anti-miR-374a-3p組SykSyk 表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。可見，miR-374a-3p 靶向調(diào)控Syk。

圖3 miR-374a-3p 靶向、調(diào)控SykFigure 3 mir-374a-3p targeting and regulating Syk

表3 雙熒光素酶報告實驗［n，（±s）］Table 3 Dual luciferase reporter experiment［n，（±s）］

表3 雙熒光素酶報告實驗［n，（±s）］Table 3 Dual luciferase reporter experiment［n，（±s）］

分組miR-NC miR-374a-3p t 值P 值n9 9 WT-Syk 1.04±0.10 0.31±0.03a 20.976 0.000 MUT-Syk 1.10±0.11 1.05±0.10 1.009 0.328

2.4 抑制Syk 對ox-LDL 作用的HUVEC 損傷及炎癥反應(yīng)的影響

與ox-LDL+si-N 組相比，ox-LDL+si-Syk 組HUVEC 中Syk、Bax 表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，TNF-α、IL-6 含量顯著降低（P＜0.05）（圖4，表4）。

圖4 抑制Syk 對ox-LDL 作用的HUVEC 凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Inhibition of Syk on HUVEC apoptosis and expression of apoptotic protein by ox LDL

2.5 過表達(dá)Syk 能逆轉(zhuǎn)miR-374a-3p 對ox-LDL 作用的HUVEC 損傷及炎癥反應(yīng)的作用

與ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1 組相比，ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1-Syk 組HUVEC中miR-374a-3p 表達(dá)水平顯著降低，Syk、Bax 表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，TNF-α、IL-6 含量顯著升高（P＜0.05）（圖5，表5）。

表4 抑制Syk 對ox-LDL 作用的HUVEC 損傷及炎癥反應(yīng)的影響［n=9，（±s）］Table 4 Inhibition of Syk on HUVEC injury and inflammatory response induced by ox LDL［n=9，（±s）］

表4 抑制Syk 對ox-LDL 作用的HUVEC 損傷及炎癥反應(yīng)的影響［n=9，（±s）］Table 4 Inhibition of Syk on HUVEC injury and inflammatory response induced by ox LDL［n=9，（±s）］

注：與ox-LDL+si-NC 組比較，a P＜0.05。

分組ox-LDL+si-NC ox-LDL+si-Syk t 值P 值細(xì)胞活性（490 nm）24 h 0.26±0.02 0.42±0.04a 10.733 0.000 48 h 0.41±0.04 0.65±0.06a 9.985 0.000 72 h 0.63±0.06 1.04±0.10a 10.547 0.000凋亡率26.39±2.66 16.21±1.71a 9.658 0.000 TNF-α（pg/mL）1685.03±166.18 826.43±85.11a 13.796 0.000 IL-6（pg/mL）414.63±45.12 143.36±15.08a 17.106 0.000

圖5 過表達(dá)Syk 能逆轉(zhuǎn)miR-374a-3p 對ox-LDL 作用的HUVEC 凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Overexpression of Syk can reverse the effect of miR-374a-3p on apoptosis and related protein expression in HUVEC induced by ox-LDL

表5 過表達(dá)Syk 能逆轉(zhuǎn)miR-374a-3p 對ox-LDL 作用的HUVEC 損傷及炎癥反應(yīng)的影響［n=9，（±s）］Table 5 Overexpression of Syk can reverse the effect of mir-374a-3p on HUVEC injury and inflammation induced by ox LDL［n=9，（±s）］

表5 過表達(dá)Syk 能逆轉(zhuǎn)miR-374a-3p 對ox-LDL 作用的HUVEC 損傷及炎癥反應(yīng)的影響［n=9，（±s）］Table 5 Overexpression of Syk can reverse the effect of mir-374a-3p on HUVEC injury and inflammation induced by ox LDL［n=9，（±s）］

注：與ox-LDL+miR-NC 組比較，a P＜0.05；與ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1 組比較，b P＜0.05。

分組ox-LDL+miR-NC ox-LDL+miR-374a-3p ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1 ox-LDL+miR-374a-3p+pcDNA3.1-Syk F 值P 值細(xì)胞活性（490 nm）24 h 0.28±0.02 0.49±0.05a 0.51±0.05 0.36±0.03b 68.191 0.000 48 h 0.37±0.04 0.74±0.07a 0.76±0.07 0.53±0.05b 88.921 0.000 72 h 0.61±0.06 1.18±0.12a 1.20±0.12 0.78±0.08b 80.312 0.000凋亡率26.19±2.62 12.51±1.28a 12.63±1.30 21.20±2.24b 107.471 0.000 Sykm RNA 1.01±0.05 0.28±0.03 0.29±0.03 0.78±0.04 810.712 0.000 TNF-α（pg/mL）1695.65±168.21 691.13±74.83a 702.04±73.58 1431.23±151.00b 151.442 0.000 IL-6（pg/mL）413.28±40.05 115.06±13.76a 114.27±13.25 336.61±34.59b 267.969 0.000

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞損傷會導(dǎo)致炎性細(xì)胞浸潤，引起炎癥反應(yīng)及一系列血管疾病，而炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）又可降低HUVEC 的增殖活性，增加其凋亡率［8-9］，抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)對相關(guān)疾病的防治具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)苦參堿通過減少炎性因子表達(dá)、抑制氧化應(yīng)激保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的HUVECs 損傷［10］。miR-21 過表達(dá)可降低HUVEC 內(nèi)炎癥因子TNF-α、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的分泌，減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC 炎癥損傷［11］。本實驗結(jié)果顯示，ox-LDL 能誘導(dǎo)HUVEC 凋亡和炎癥因子的釋放。而過表達(dá)miR-374a-3p 后TNF-α、IL-1β、IL-6 含量降低，細(xì)胞凋亡率降低。還有研究報道m(xù)iR-374a 可通過負(fù)調(diào)控MCP-1 的表達(dá)抑制糖尿病性腎病的炎癥反應(yīng)［12］。miR-374a-5p 過表達(dá)可減少氧/葡萄糖剝奪處理的PC12 細(xì)胞凋亡［13］。而本實驗研究結(jié)果與其相一致，說明過表達(dá)miR-374a-3p 保護(hù)可保護(hù)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC 損傷，減輕炎癥反應(yīng)。

研究報道干擾Syk 表達(dá)，caspase-3 活性和細(xì)胞凋亡顯著降，保護(hù)缺氧/缺糖損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡［14］。抑制Syk 還可降低脂多糖誘導(dǎo)的TNF-α 和IL-6 的釋放，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生［15］。本實驗結(jié)果顯示，ox-LDL 作用的HUVEC 中Syk 高表達(dá)，抑制Syk 表達(dá)后Bax 表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，TNF-α、IL-6 含量顯著降低。說明抑制Syk 表達(dá)可抑制HUVEC 凋亡和炎癥反應(yīng)，保護(hù)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC 損傷。研究發(fā)現(xiàn)沉默miR-27a 通過激活Syk 依賴的mTOR 信號傳導(dǎo)途徑促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的自噬和凋亡［16］。提示Syk 可被miRNA 調(diào)控進(jìn)而影響細(xì)胞的凋亡。本實驗結(jié)果顯示，miR-374a-3p 可靶向調(diào)控Syk，過表達(dá)Syk逆轉(zhuǎn)了miR-374a-3p 對ox-LDL 作用的HUVEC 損傷及炎癥因子釋放的抑制作用。表明，miR-374a-3p可能通過調(diào)控Syk 保護(hù)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC損傷，減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，過表達(dá)miR-374a-3p 可抑制HUVEC凋亡和炎癥因子的釋放，保護(hù)ox-LDL 引起的HUVEC 損傷及炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與Syk 有關(guān)。