血管內(nèi)皮生長因子基因936C/T位點多態(tài)性與急性心肌梗死的關系

常亞偉 李賽 琚紹坦

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是臨床常見的心血管系統(tǒng)疾病，病情較重，具有較高的致殘率和致死率。近年來，我國AMI的發(fā)病率不斷升高且發(fā)病人群呈年輕化趨勢，已經(jīng)成為威脅國民健康的公共衛(wèi)生問題。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是具有強大促血管新生作用的細胞因子，在AMI、腦梗死等缺血性疾病的發(fā)病過程中，能夠促進新生血管形成、增加血管通透性，有利于改善缺血組織的血流灌注［1］；多項動物實驗也證實VEGF 能夠減輕AMI 大鼠的心肌損傷［2-4］。人的VEGF基因位于染色體6q21，位于3′非編碼區(qū)的rs3025039 位點（936C/T）是常見的基因多態(tài)性位點，發(fā)生胞嘧啶（C）向胸腺嘧啶（T）的突變已經(jīng)被證實與腦梗死的發(fā)生有關［5］，但VEGF基因936C/T 多態(tài)性在AMI 中的作用尚未完全闡明。因此，本研究旨在探討VEGF基因936C/T 多態(tài)性與AMI 的關系，以期從基因角度闡明AMI 發(fā)病的易感因素、為篩查AMI 高危人群提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016年7月至2018年12月在本院且首次診斷為AMI 的120 例患者作為AMI 組，入組標準：①符合中華醫(yī)學會心血管病學分會指定的《急性心肌梗死診斷和治療指南》［6］中的判斷標準；②臨床資料及臨床樣本完整。排除標準：①肝腎功能不全；②合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液疾?。虎奂韧行募」Ｋ?、腦梗死病史。另取同期在本院進行健康體檢的150 例志愿者作為對照組。本研究的方案獲倫理委員會審批同意，所有入組對象均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

全血基因組DNA 提取試劑盒、PCR 酶預混液購自美國賽默飛公司。VEGF基因936C/T 位點的引物由上海生工公司合成，序列如下：上游5′-CTGAAATGAAGGAAGAGGAGAC-3′ 、下 游5′ -TCCCCTCCCAACTCAAGTCCAC-3′；美國BIORAD 伯樂T100 型梯度PCR 儀為艾本德公司，德國耶拿UVP Gelstudio touch 凝膠成像儀為南京世研儀器公司。

1.3 方法

1.3.1VEGF（936C/T）基因多態(tài)性的檢測

取AMI 組和對照組的肘靜脈血2 mL（EDTA抗凝），用全血基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，采用PCR 酶預混液、配置PCR 反應體系，具體如下：基因組DNA 2 μL、PCR 酶預混液10 μL、10 pmol/L 的上下游引物各0.4 μL、去離子水7.2 μL，按下列程序進行PCR 反應：95℃預變性10 min，而后95℃變性40 s、54℃退火40 s、72℃延伸40 s，重復40 個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸50 s、得到PCR 產(chǎn)物。PCR 產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進行酶切反應，酶切反應體系為PCR 產(chǎn)物1 μL，限制性內(nèi)切酶10 U，去離子水補足至10 μL，37℃水浴過夜，次日酶切產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳100 V，60 min，瓊脂糖凝膠在凝膠成像儀中顯影得到酶切產(chǎn)物的圖像，根據(jù)圖像判斷VEGF基因936C/T 位點的多態(tài)性：364 bp 一個片段為CC 基因型、249 bp、115 bp 兩個片段為TT 基因型、364 bp、249 bp、115 bp 3個片段為CT基因型，如圖1。

1.3.2 觀察指標

兩組受試者的性別、年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史、總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）、磷酸肌酸激酶同工酶（Creatine Kinase Isoenzyme-MB，CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin，cTnI）。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis

1.4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以（）表示，兩組間均數(shù)的比較采用獨立樣本t檢驗或非參數(shù)秩和檢驗，計數(shù)資料以n（%）表示。采用χ2檢驗。采用二分類Logistic 回歸分析危險因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般臨床資料資料比較

AMI 組的年齡、吸煙率、高血壓率、糖尿病率、高脂血癥率、高Hcy 血癥率及血清TC、LDL-C、VEGF 水平均明顯高于對照組，血清HDL-C 水平明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。性別、飲酒率、TG 水平比較兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組基線資料比較［n（%）］Table 1 comparison of basic clinical characteristics between 2 groups［n（%）］

2.2 兩組VEGF 基因型及等位基因頻率分布比較

兩組間VEGF基因936C/T 位點基因型及等位基因頻率的分布，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組VEGF 基因型及等位基因頻率的比較 ［n（%）］Table 2 Comparison of VEGF genotype and allele frequency between two groups［n（%）］

2.3 AMI 組中不同VEGF 基因型患者血清指標的比較

AMI 組中VEGF基因936C/T 位點CT+TT 基因型患者的血清CK-MB 峰值、cTnI 峰值明顯高于CC 基因型患者，血清VEGF 水平明顯低于CC 基因型患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CC 基因型與CT+TT 基因型患者血清TG、TC、LDL-C、HDL-C、Hcy 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 AMI 組中不同VEGF 基因型患者血清指標的比較［n，（±s）］Table 3 Comparison of serum indexes between patients with different VEGF genotype in AMI group［n，（±s）］

表3 AMI 組中不同VEGF 基因型患者血清指標的比較［n，（±s）］Table 3 Comparison of serum indexes between patients with different VEGF genotype in AMI group［n，（±s）］

項目TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）Hcy（mmol/L）BG（mmol/L）VEGF（ng/mL）CK-MB 峰值（U/L）cTnI 峰值（ng/mL）CT+TT 基因型（n=79）1.90±0.45 4.93±0.96 3.08±0.77 1.01±0.23 12.94±2.85 6.77±0.94 89.12±14.58 429.69±83.94 4.67±1.33 CC 基因型（n=41）1.84±0.39 5.16±0.89 2.93±0.70 1.09±0.20 13.09±3.44 6.44±1.04 125.24±19.22 338.14±67.62 4.11±1.19 t 值0.724 1.275 1.043 1.887 0.254 1.758 11.512 6.037 2.265 P 值0.471 0.247 0.299 0.062 0.800 0.081 0.000 0.000 0.025

2.4 AMI 相關危險因素的Logistic 回歸分析

采用逐步回歸方法篩選危險因素，分析結果顯示：年齡、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥、VEGF基因CT+TT 基因型是AMI 發(fā)生的獨立危險因素。其中，與VEGF基因CC 基因型比較，CT+TT 基因型患者發(fā)生AMI 的風險增加見表4。

表4 AMI 相關危險因素的Logistic 回歸分析Table 4 Logistic regression analysis of related risk factor for AMI

3 討論

VEGF 是直接作用于血管內(nèi)皮細胞的促有絲分裂因子，能夠促進新生血管形成、增加血管通透性。在心肌梗死、腦梗死等缺血性疾病中，VEGF通過其促血管新生及增加血管通透性的作用能夠增加缺血病灶的側(cè)枝循環(huán)及血流灌注，進而減輕局部組織的缺血缺氧損傷。多項臨床研究報道，心肌梗死及腦梗死患者血清中VEGF 的含量增多［7-9］；本研究對AMI 患者血清VEGF 的分析與已有的報道一致，即AMI 組血清VEGF 含量明顯增多，分析認為VEGF 的增多可能是機體在缺血缺氧狀態(tài)下自我保護及自身代償?shù)臋C制。另有研究報道，AMI 預后不良患者的血清VEGF 含量低于預后良好患者［10］，由此更加印證了VEGF 增多是AMI 發(fā)生后的一種自我保護及自身代償，預后不良患者VEGF 含量較低提示自我保護及自身代償不足，VEGF 介導的促進新生血管形成、增加血管通透性作用較弱，因而遠期預后較差。

VEGF 分泌的調(diào)控機制復雜，缺血缺氧、炎癥及氧化應激等刺激會增加VEGF 的表達和分泌［11-13］，編碼VEGF 的基因本身存在多態(tài)性也會影響VEGF 的表達和分泌。目前已知VEGF基因多態(tài)性的位點超過30 個，其中研究較為成熟的多態(tài)性位點是3′非翻譯區(qū)上的936C/T 位點，該位點C向T 突變增多已經(jīng)被證實與急性腦梗死的發(fā)生有關［14-15］。本研究對AMI 患者VEGF基因936C/T 多態(tài)性的分析顯示：AMI 組VEGF基因936C/T 位點CT+TT 基因型的比例及等位基因T 的頻率明顯增加，說明VEGF基因936C/T 位點C 向T 突變的增多與AMI 的發(fā)生有關。936C/T 位點位于VEGF基因的3′ 非翻譯區(qū)，發(fā)生C 向T 的突變后會影響miRNAs 與3′非翻譯區(qū)的結合及對基因表達的調(diào)控，進而可能影響心肌梗死發(fā)生后VEGF表達增多對心肌缺血損傷的自身代償，加重AMI 的病情。在本研究中，不同基因多態(tài)性AMI 患者血清心肌酶及VEGF 的分析印證了這一猜想，CT+TT 基因型AMI 患者的血清VEGF 含量低于CC 基因型AMI 患者，CK-MB 及cTnI 峰值高于AMI 患者，說明AMI 發(fā)生后雖然存在VEGF 分泌增多的自身代償機制，但當基因936C/T 位點發(fā)生C 向T 的突變時，VEGF 的分泌相對較少、自身代償也較弱，進而出現(xiàn)了更為嚴重的心肌缺血缺氧、反應心肌損傷的CK-MB 及cTnI 峰值也較高。

AMI 的發(fā)生與環(huán)境、飲食、遺傳等多種因素有關，本研究對AMI 患者除了VEGF 外的其他多種指標也進行了分析，結果顯示：AMI 組患者的年齡、吸煙率、高血壓率、糖尿病率、高脂血癥率、高Hcy 血癥率及血清TC、LDL-C 水平均較高；經(jīng)Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)：年齡、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥、高Hcy 血脂是AMI 的危險因素，這與既往多項關于AMI 發(fā)病危險因素的研究［16-18］吻合，年齡、吸煙、血壓、血糖、血脂、血Hcy 均會影響AMI 的發(fā)生。但是在不同VEGF基因多態(tài)性的AMI 患者中，血糖、血脂、血Hcy 的水平無明顯差異，說明VEGF基因多態(tài)性雖然會影響VEGF 的分泌及心肌損傷的嚴重程度，但是對血糖、血脂、血Hcy 的代謝并無影響。此外，本研究通過Logistic回歸分析還發(fā)現(xiàn)：VEGF基因936C/T 位點CT+TT基因型是AMI 的危險因素，CT+TT 基因型患者發(fā)生AMI 的風險是CC 基因型患者的1.774 倍。但是，VEGF基因發(fā)生上述突變后對VEGF 表達及分泌的直接影響、可能通過靶向VEGF基因936C/T位點的miRNAs 等均有待闡明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)VEGF基因936C/T位點多態(tài)性與AMI 的發(fā)生有關，VEGF基因CT+TT基因型是AMI 的危險因素，等位基因T 可能是AMI 發(fā)生的易感等位基因。本研究的結果對篩查AMI 的高危人群具有一定指導價值。但是，本研究未對AMI 患者的長期預后進行隨訪，根據(jù)VEGF 的代償功能，VEGF基因CT+TT 基因型可影響VEGF 的分泌及其代償功能，進而可能在長期病情轉(zhuǎn)歸中產(chǎn)生影響，因此今后可進一步延長隨訪時間、分析VEGF基因多態(tài)性對遠期主要心血管事件的影響。