甲基化熒光定量PCR快速檢測(cè)自閉癥男童中脆性X綜合征的臨床應(yīng)用

陳劍虹 黃淑君 馬健 周偉平 張亮★

脆性X綜合征是造成智力低下和自閉癥譜系障礙的主要單基因病因［1-2］，這種X 連鎖綜合征主要是由于脆性X 智力低下基因1（fragile X mental retardation 1，F(xiàn)MR1）基因5′非編碼區(qū)的（CGG）n 異常擴(kuò)增導(dǎo)致的。

常用的分子遺傳學(xué)檢測(cè)方法有基于DNA 水平的Southern blot 法［3］和PCR 法。Southern blot 作為診斷脆性X 的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要DNA 量大，不適合臨床常規(guī)使用?；贒NA的PCR 方法簡(jiǎn)單快速，包括檢測(cè)FMR1基因5′非編碼區(qū)CGG 重復(fù)數(shù)和啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)兩種，臨床應(yīng)用最多的是檢測(cè)CGG 重復(fù)數(shù)的側(cè)翼PCR（flanking PCR，F(xiàn)-PCR）［4-5］。F-PCR 法針對(duì)FMR1基因所在位置的CGG 富集區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用毛細(xì)管電泳的方法進(jìn)行判讀。F-PCR 法由于大片段重復(fù)不易擴(kuò)增，只能檢測(cè)一定的CGG 重復(fù)數(shù)，超出范圍的病例易造成漏檢。已有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)CGG 重復(fù)數(shù)達(dá)到全突變水平，會(huì)同時(shí)伴隨FMR1啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的異常甲基化［6］。而有文獻(xiàn)報(bào)道CGG 重復(fù)達(dá)到全突變的男性當(dāng)CpG 島不發(fā)生甲基化，并無明顯臨床癥狀的案例［7-8］。說明甲基化是引起FMR1基因功能失活、造成脆性X 智力低下蛋白（fragile X mental retardation protein，F(xiàn)MRP）缺失引發(fā)脆性X綜合征更重要的原因。已有一些研究針對(duì)檢測(cè)FMR1啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的甲基化情況［9］，但由于操作繁瑣臨床上尚未得到廣泛應(yīng)用。本研究建立了一種新的TaqMan 探針甲基化實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（quantitative methylation-specific PCR，qMSP），并在自閉癥男童中檢測(cè)外周血FMR1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)，建立一種快速準(zhǔn)確檢測(cè)脆性X綜合征的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年1月至2018年4月在廣東省婦幼保健院經(jīng)過F-PCR 確診為脆性X綜合征男童3例，年齡范圍：3～6 歲，中位數(shù)在4 歲2 個(gè)月，正常男童20 例、女童3 例，年齡范圍：3～9 歲，中位數(shù)在5 歲3 個(gè)月，外周血DNA 保存于-20℃冰箱。測(cè)試組：2018年4月收集惠州市護(hù)苗培智學(xué)校中自閉癥男童54 名，年齡范圍：3～8 歲，中位數(shù)在4 歲5 個(gè)月外周血2mL，保存于EDTA 抗凝管中。已知組和測(cè)試組2 組人群年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.56），年齡不會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

所有受試者均簽署知情同意。入組的自閉癥患兒均滿足美國(guó)精神疾病協(xié)會(huì)2010年2月發(fā)布的《精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第五版對(duì)兒童自閉癥譜系障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)［10］。本研究已經(jīng)惠州市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 方法

1.2.1 試劑/儀器

引物探針均合成于上海百力格生物技術(shù)有限公司，DNA 亞硫酸鹽處理試劑盒（磁珠法）購(gòu)自上海敬善生物科技有限公司。亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA 所使用的PCR 擴(kuò)增體系2×GoldStar TaqMan Mixture購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。熒光定量PCR 儀器為ABI 7500 Fast Real-Time PCR System。FMR1基因甲基化陽(yáng)性樣本和其母親血樣由蘇州珀金埃爾默醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所用F-PCR 其檢測(cè)CGG 重復(fù)數(shù)。

1.2.2 血液DNA 提取

采用廣州賽哲生物科技有限公司的磁珠試劑盒提取54 例自閉癥男童全血DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA 純度和濃度，DNA 樣本置-20℃保存。

1.2.3 甲基化實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative methylation-specific PCR，qMSP）

在經(jīng)過亞硫酸鹽處理后，發(fā)生了甲基化的CpG 島保持CG 序列，而沒有發(fā)生甲基化的CpG島則轉(zhuǎn)化為UG 序列。本研究設(shè)計(jì)的FMR1基因的引物、探針是針對(duì)亞硫酸鹽處理后仍然保持CG序列的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)。上游引物FMR1-F：5′-TGATTTTTTACGTTATTGAGT-3′ ，下 游 引 物FMR1-R：5′-GAATCGAAAAACAAACGC-3′，探針FMR1-P：5′-CACTACCTCGCGAAAACCAA-3′（5′-FAM，3′-MGB 修飾）。內(nèi)參ACTB基因引物探針設(shè) 計(jì)：ACTB-F：5′-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3′ ACTB-R：5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′，ACTB-P：5′-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3′（5′-HEX，3′-BHQ1 修飾）。擴(kuò)增條件93℃10 min；然后56℃1 min、65℃30 s（收集熒光）、94℃30 s，50 個(gè)循環(huán)；40℃10 s。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用t檢驗(yàn)對(duì)納入的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比檢驗(yàn)，差異大小采用P值判斷。P＞0.05 表示兩組數(shù)據(jù)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05 表示兩組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 已知基因型樣本的qMSP 檢測(cè)結(jié)果

在正常男性的DNA 樣本中，內(nèi)參基因ACTB陽(yáng)性（Ct 值26.73～28.93），F(xiàn)MR1基因甲基化陰性。脆性X綜合征男性患者內(nèi)參基因ACTB陽(yáng)性（Ct 值26.95～27.98），F(xiàn)MR1基因陽(yáng)性（Ct 值27.11～29.57），平均△Ct=1.18。正常女性內(nèi)參基因ACTB陽(yáng)性（Ct 值27.23～29.85），F(xiàn)MR1基因陽(yáng)性（Ct 值29.68～32.64），平均△Ct=2.64（見圖1）。

圖1 已知脆性X 患者FMR1 甲基化類型的qMSP 結(jié)果Figure 1 qMSP results of samples with known methylation status

2.2 特殊學(xué)校男童qMSP 檢測(cè)結(jié)果

鑒于本研究建立起來的體系在測(cè)試已知樣本時(shí)穩(wěn)定可靠，對(duì)惠州市護(hù)苗培智學(xué)校54 名3～8 歲自閉癥男童行本研究qMSP 檢測(cè)，有1 例檢測(cè)到FMR1陽(yáng)性信號(hào)（Ct 值30.69）（見圖2），檢出率為1.85%。

圖2 檢出一例甲基化陽(yáng)性男性患兒的qMSP 結(jié)果Figure 2 qMSP result from a boy detected positive FMR1 methylation

2.3 qMSP 陽(yáng)性結(jié)果F-PCR 復(fù)核結(jié)果

為了確認(rèn)qMSP 檢出FMR1基因甲基化陽(yáng)性的男童的CGG 具體重復(fù)次數(shù)，以及其母親是否為CGG 的前突變，經(jīng)過蘇州珀金埃爾默醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所F-PCR 檢測(cè)，確認(rèn)該男童的CGG 重復(fù)數(shù)為383，為全突變?？纱_診其自閉癥的真實(shí)原因?yàn)榇嘈訶綜合征。其母親無臨床癥狀，F(xiàn)-PCR 檢測(cè)CGG 拷貝數(shù)為30 和81，為前突變攜帶者。F-PCR 結(jié)果參見圖3 和圖4。

圖4 qMSP 陽(yáng)性男童母親的F-PCR 方法判讀的CGG 重復(fù)次數(shù)圖為30 和81Figure 4 F-PCR result of the positive boy's mother with 30 CGG copies and 81 copies

3 討論

脆性X綜合征是由于FMR1基因5′非編碼區(qū)CGG 重復(fù)數(shù)過度擴(kuò)增，當(dāng)大于200 拷貝時(shí)，引起FMR1基因啟動(dòng)子區(qū)域高度甲基化導(dǎo)致基因沉默，其編碼的蛋白FMRP 表達(dá)減少，造成智力低下或性格孤僻等一系列臨床癥狀［11］。以此為基礎(chǔ)，出現(xiàn)了多種檢測(cè)方法，臨床最常用的是檢測(cè)CGG 重復(fù)數(shù)的F-PCR 法診斷脆性X綜合征，但該方法有擴(kuò)增CGG 重復(fù)次數(shù)上限［12］。我院也根據(jù)文獻(xiàn)建立了F-PCR 方法，發(fā)現(xiàn)CGG 重復(fù)片段較多時(shí)，就難以擴(kuò)增成功。故本研究把qMSP 檢測(cè)為陽(yáng)性的男童及其母親血液DNA 樣本外送蘇州珀金埃爾默醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行復(fù)核確認(rèn)。另外，由于有發(fā)現(xiàn)CGG 重復(fù)次數(shù)為全突變卻不發(fā)生甲基化，并且沒有臨床癥狀的案例的報(bào)道［7-8］，使得人們更加清晰地認(rèn)識(shí)到甲基化導(dǎo)致的基因沉默才是導(dǎo)致脆性X綜合征的根本原因，致使越來越多的關(guān)注投放到甲基化的檢測(cè)上。

國(guó)內(nèi)已報(bào)道的通過PCR 檢測(cè)FMR1基因甲基化狀態(tài)的方法有：甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶定量PCR（methylation-sensitive restriction enzymesbased quantitative PCR，MSRE-qPCR）［13］、甲基化特異性多重連接探針擴(kuò)增（methylation specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MSMLPA）［14］。限制性內(nèi)切酶只能識(shí)別一種酶切位點(diǎn)，對(duì)于其它形式的甲基化CG 不能切割，易造成偏差，且存在消化不完全的問題，操作繁瑣，不適合臨床應(yīng)用。而MS-MLPA 需要設(shè)計(jì)多對(duì)探針后續(xù)還要進(jìn)行毛細(xì)管電泳，操作煩瑣價(jià)格昂貴，不適合大規(guī)模檢測(cè)。2009年美國(guó)艾莫利大學(xué)采用與本研究相似的qMSP 法篩查3 萬(wàn)多名新生男嬰的FMR1甲基化情況［15］，操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，且費(fèi)用低。國(guó)內(nèi)迄今還未見qMSP 應(yīng)用于臨床檢測(cè)脆性X綜合征的報(bào)道。qMSP 的核心也是難點(diǎn)在于，亞硫酸鹽處理后的DNA 的GC 含量嚴(yán)重下降，在這樣的DNA 模板上需要設(shè)計(jì)合適的引物探針來檢測(cè)CpG 序列的存在并保持qPCR 反應(yīng)的高效性和特異性。本研究克服了這一難題，建立一種qMSP 方法，可以為臨床檢測(cè)脆性X綜合征臨床提供一種新的選擇。

本方法首先在已知樣本中確認(rèn)FMR1啟動(dòng)子區(qū)CpG 島甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示正常男性FMR1是非甲基化的，正常女性和脆性X綜合征男性患者FMR1是甲基化的，與實(shí)際一致，說明本方法穩(wěn)定可靠。2015年，國(guó)內(nèi)首都兒科研究所采用毛細(xì)管電泳檢測(cè)CGG 重復(fù)數(shù)的方式篩查540 例智力低下男童檢出5 例脆性X 陽(yáng)性，檢出率0.93%［17］，可能與僅采用F-PCR 毛細(xì)管電泳檢測(cè)CGG 重復(fù)數(shù)診斷脆性X綜合征造成的漏檢有關(guān)。本研究的檢出率高于2015年首都兒研所的研究，可能甲基化檢測(cè)更為準(zhǔn)確，但低于參考發(fā)病率，可能與本文入組的樣本只為自閉癥有關(guān)。

基于一般的三甲醫(yī)院都已經(jīng)有熒光定量PCR儀，因此qMSP 是一項(xiàng)快速篩查自閉癥或者智力低下男童是否為脆性X綜合征的較理想方案。但由于正常女性的一條染色體存在自然失活的狀態(tài)，其上的FMR1基因也發(fā)生了甲基化，因此qMSP 其不能用于在女性中檢測(cè)FMR1的前突變和全突變。