WGA、RDB結(jié)合STR單體型分析在β-地中海貧血胚胎植入前遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用

李伍高 嚴(yán)提珍 李哲濤 唐永梅 秦祖興 李忻琳 蔡稔★

β-地中海貧血（β-thalassemia，簡(jiǎn)稱“β-地貧”），是一組全球最常見、對(duì)人類健康影響最大的常染色體單基因隱性遺傳病之一。在中國，多發(fā)于南部沿海地區(qū)，其中以廣西、海南、廣東常見，分子流行性病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示廣西β-地貧致病基因攜帶率為6.43%［1］。β-地貧分為點(diǎn)突變型和缺失型，以點(diǎn)突變型最為常見。

目前預(yù)防和控制地貧的診斷方法包括傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷和植入前遺傳學(xué)診斷（Preimplantation Genetic diagnosis，PGD）。前者是在不同孕周進(jìn)行絨毛膜取絨毛或羊膜腔穿刺抽取羊水或臍帶血等方法對(duì)已孕胚胎進(jìn)行基因診斷，而PGD 是將常規(guī)產(chǎn)前診斷提早到胚胎于子宮著床之前進(jìn)行活檢和遺傳學(xué)分析，選擇無遺傳性疾病的胚胎植入子宮腔內(nèi)，從而獲得正常胎兒的診斷方法。目前應(yīng)用于β-地貧PGD 的方法包括：巢式PCR 結(jié)合變性梯度凝膠電泳（denaturing gel gradient electrophoresis，DGGE）分析技術(shù)［2］、應(yīng)用引物延伸預(yù)擴(kuò)增方法［3］、全基因組擴(kuò)增技術(shù)（whole genome amplification，WGA）［4］、單細(xì)胞巢式PCR 技術(shù)［5-7，16］、Taq-Man-MGB 探針實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)［8］、突變擴(kuò)增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）技術(shù)［9］、熒光共振能量轉(zhuǎn)移雜交探針實(shí)時(shí)PCR 技術(shù)［10］、多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification，MDA）結(jié)合巢式PCR 技術(shù)［11］、短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）序列單體型分析技術(shù)［12-13］、熒光PCR 、技術(shù)［14-15］。希臘［2］、印度［9］、臺(tái)灣［10］、新加坡［12］、伊朗［13-15］、意大利［16］、中國［3-8，11］都有β-地貧PGD 的成功案例。近幾年國內(nèi)學(xué)者利用胚胎培養(yǎng)基成功進(jìn)行β-地貧IVS-II 654 突變的無創(chuàng)植入前胚胎遺傳學(xué)檢測(cè)［17］。本研究分析2017年1月至2018年12月在本院進(jìn)行β-地貧PGD 的周期資料，探討WGA 結(jié)合致病位點(diǎn)檢測(cè)和STR 序列單體型分析進(jìn)行β-地貧PGD 的效果。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

分析本中心2017年1月至2018年12月進(jìn)行β-地中海貧血PGD 的檢測(cè)資料，納入研究71 個(gè)檢測(cè)周期合計(jì)501 個(gè)胚胎，該項(xiàng)目通過柳州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20170221029），且每對(duì)夫婦均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 STR 位點(diǎn)的鑒定和選擇

利用UniSTS 和UCSC 數(shù)據(jù)庫選擇15 個(gè)與β-珠蛋白基因緊密關(guān)聯(lián)的STR 標(biāo)記（HBB4506、D11S988、HBB4677、D11S2362、HBB5089、D11S1243、HBB5138、HBB5178、HBB5205、D11S1760、HBB5576、HBB5655、HBB5820、HBB5859、D11S1338）。為提高診斷的準(zhǔn)確性和減少人工stutter 峰的干擾，所有選擇的STR 位點(diǎn)均為三核苷酸或四核苷酸重復(fù)，用Oligo7.56 軟件設(shè)計(jì)STR 序列引物，由生工生物（上海）股份有限公司合成。隨后，對(duì)260 例無血緣關(guān)系的健康個(gè)體進(jìn)行基因分型，以評(píng)估每個(gè)STR 位點(diǎn)的基因型頻率。

1.2.2 囊胚滋養(yǎng)外胚層活檢

采取常規(guī)排卵方案促排卵，行ICSI 授精，授精后16～18 小時(shí)觀察受精情況，取卵后對(duì)第5 天囊胚評(píng)分為3BB 以上、第6 天囊胚評(píng)分為4CB/4BC 以上的胚胎采用激光法打孔，活檢4～10 個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞。

1.2.3 全基因組擴(kuò)增

全基因組擴(kuò)增試劑盒采用德國QIAGEN 公司的REPLI-g Single Cell Kit。將活檢出的細(xì)胞移入PBS 中洗滌3 次，裝入3.5 μL PBS 緩沖液200 μL PCR 管中，同時(shí)取最后一次洗滌的PBS 2 μL 轉(zhuǎn)入陰性對(duì)照管中；加入3.5 μL D2 試劑65℃裂解10 min，冰盒保存加入3.5 μL 終止液，瞬時(shí)離心；加入9 μL 超純水，29 μL REPLI-g 反應(yīng)緩沖液，Polymerase 2 μL，上PCR 儀30℃8 h，95℃5 min，4℃保存，取1.0 μL 產(chǎn)物稀釋100 倍使用。

1.2.4 STR 位點(diǎn)檢測(cè)

分為單管15 重，引物100 pmol/μL 等體積混合 備 用，10×PCR Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/μL dNTPs 2.5 μL，DMSO 5.0 μL，Hot star Taq（TAKARA，大連）0.5 μL，混合引物4.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 33 μL。95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸60 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃后延伸30 min，12℃保存。

1.2.5 毛細(xì)管電泳

利用美國ABI3500Dx 遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，體系：Genescan 500LIZ Size standard（0.5+9.0）μL HI-DI 甲酰胺+1.0 μL PCR 產(chǎn)物；95℃變性5 min，迅速冰浴冷卻5 min。

1.2.6 致病位點(diǎn)檢測(cè)

常見位點(diǎn)使用β-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（深圳益生堂）進(jìn)行反向點(diǎn)雜交（reverse dot blot，RDB）檢測(cè)，按說明書操作，罕見位點(diǎn)利用Sanger 測(cè)序檢測(cè)，外送上海立菲生物技術(shù)有限公司。

1.2.7 胚胎移植均為單囊胚移植，專人負(fù)責(zé)隨訪。

2 結(jié)果

2.1 15 個(gè)STR 位點(diǎn)的雜合度情況

根據(jù)各STR 位點(diǎn)觀察到的等位基因數(shù)及等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)D11S1243 雜合度最高，為0.90；最低為HBB5178，為0.62，15 個(gè)STR 位點(diǎn)雜合度高，適合應(yīng)用于β-地中海貧血胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)的單體型構(gòu)建。見表1。

表1 15 個(gè)STR 位點(diǎn)的雜合度Table 1 Heterozygosity of 15 STR loci

2.2 β-地貧PGD 的結(jié)果

71 個(gè)周期501 枚囊胚基因檢測(cè)結(jié)果及部分家系STR單倍型分析結(jié)果。中69 對(duì)夫妻進(jìn)行了移植，移植周期92 個(gè)，生化妊娠率63.04%，臨床妊娠率53.26%，合計(jì)45 對(duì)夫婦進(jìn)行了產(chǎn)前診斷或流產(chǎn)物分析，與胚胎檢測(cè)結(jié)果一致性為100%。見表2，圖1。

Ⅰ-1（父親）β-28突變攜帶者，Ⅰ-2（母親）為β41-42突變攜帶者，有6 個(gè)囊胚，其中Ⅱ-1（胚胎1）為未攜帶突變的正常胚胎，Ⅱ-2（胚胎2）和Ⅱ-5（胚胎5）的STR 結(jié)果分別提示可能為單體和三體，Ⅱ-3（胚胎3）為β41-42突變攜帶者，Ⅱ-4（胚胎4）和Ⅱ-6（胚胎6）為β-28/β41-42復(fù)合雜合突變地貧胚胎。

表2 71 個(gè)周期501 枚囊胚基因檢測(cè)結(jié)果Table 2 The results of 501 blastocyst gene test in 71 cycles

圖1 部分家系STR單倍型分析結(jié)果Figure 1 STR haplotypes analysis in some families

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，越來越多的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用到胚胎植入前遺傳學(xué)診斷。但是不可避免出現(xiàn)單細(xì)胞PCR 產(chǎn)物少、擴(kuò)增失敗、等位基因脫扣（allele drop out，ADO）等問題，故歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會(huì)（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）推薦DNA 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)中除了致病基因之外，還應(yīng)包括相鄰的相關(guān)及不相關(guān)位點(diǎn)，通過高度多態(tài)性標(biāo)志物的分析，可以判斷外源性DNA 污染及ADO，從而提高單基因病PGD 準(zhǔn)確率［18］。WGA 結(jié)合PCR 及其衍生的PCR 技術(shù)、STR 位點(diǎn)單體型構(gòu)建成本低廉，可給需要進(jìn)行PGD 治療的患者降低經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且誤診率低、檢測(cè)成功率高，能滿足日常的臨床檢測(cè)需求，故應(yīng)用廣泛。

目前WGA 技術(shù)主要有四種：簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR 擴(kuò)增（Degenerate oligonucleotide primer-PCR，DOP-PCR）、多重置換擴(kuò)增（MDA）、置換預(yù)擴(kuò)增和PCR 擴(kuò)增的組合（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）和轉(zhuǎn)座子插入線性擴(kuò)增（Linear Amplification with Transposon Insertion，LIANTI）［19-20］。WGA 技術(shù)通過非選擇性地?cái)U(kuò)增活檢的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA，在真實(shí)反映基因組全貌的基礎(chǔ)上最大限度地增加其DNA 量，為后續(xù)分析提供足量的DNA模板［19］，在單體型構(gòu)建方面，我們應(yīng)用的是短串聯(lián)重復(fù)序列，目前應(yīng)用于β-地貧胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)的STR 位點(diǎn)較少［13，15］，而且由于雜合度問題，選擇的STR 位點(diǎn)不是每個(gè)點(diǎn)都能應(yīng)用到單體型構(gòu)建來分析胚胎檢測(cè)結(jié)果。這就使得實(shí)際上每對(duì)進(jìn)行PGD 的夫婦所用得到的STR 位點(diǎn)更加少，造成胚胎檢測(cè)結(jié)果不明確風(fēng)險(xiǎn)增加，更多的時(shí)候需要增加STR 位點(diǎn)來進(jìn)行檢測(cè)［12］，本研究選擇的15 個(gè)STR 位點(diǎn)雜合度均超過0.5，能滿足單體型構(gòu)建。

β-地貧是常見的常染色體隱形遺傳病，符合經(jīng)典的孟德爾遺傳規(guī)律，正常：攜帶：重型比例約為1∶2∶1。在本研究結(jié)果中，正常比例21.35%（101/473），攜帶者比例49.05%（232/473），重型β-地貧比例23.89%（113/473），約為1∶2∶1，符合孟德爾遺傳規(guī)律，可間接的證明該檢測(cè)技術(shù)的安全性。

在進(jìn)行胚胎移植過程中，筆者優(yōu)先選擇移植正常胚胎，攜帶者胚胎次之，如無胚胎可移植的情況下選擇致病位點(diǎn)檢測(cè)為正?；驍y帶者而STR 提示重組的胚胎；重型β-地貧和STR 提示11 號(hào)染色體發(fā)生拷貝數(shù)變異的胚胎不考慮移植，均進(jìn)行單囊胚移植。

通過檢測(cè)結(jié)果較符合孟德爾遺傳規(guī)律，而且產(chǎn)前診斷符合率高，雖然越來越多的技術(shù)應(yīng)用到β-地貧植入前遺傳學(xué)診斷，但是利用全基因組擴(kuò)增結(jié)合STR單體型分析和致病位點(diǎn)進(jìn)行β-地貧胚胎植入前遺傳診斷仍不失為一種不錯(cuò)的選擇。