基于納米孔測(cè)序技術(shù)的呼吸道病原體快速確認(rèn)

葉福強(qiáng) 李鵬 韓一芳 張琪 林彥鋒 王凱英 王太武 宋宏彬 王長(zhǎng)軍 汪春暉 張錦?！?/p>

近年暴發(fā)的西非埃博拉出血熱（2014年）、巴西寨卡病毒?。?015年）和尼日利亞拉薩熱疫情（2018年）等新發(fā)傳染病對(duì)疫區(qū)民眾的生命健康造成巨大威脅［1-6］。為了有效遏制傳染病蔓延，亟需快速有效的病原體檢測(cè)確認(rèn)技術(shù)。常用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)對(duì)未知病原或高突變率病原檢測(cè)能力有限。現(xiàn)有的二代高通量測(cè)序平臺(tái)雖然具備鑒別病原微生物的能力［1，7-11］，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求苛刻，文庫制備流程復(fù)雜，也限制其大規(guī)模的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)應(yīng)用。

由Oxford Nanopore Technologies（ONT）開發(fā)的三代測(cè)序平臺(tái)MinION，通過捕捉DNA/RNA 經(jīng)過納米孔時(shí)引起的電流變化來鑒別核苷酸［12-13］。其在病原體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面具有諸多優(yōu)勢(shì)：①便攜。總質(zhì)量?jī)H為87 g，可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)［14-17］。②供電方式簡(jiǎn)單。USB 3.0 接口即可保證測(cè)序儀穩(wěn)定運(yùn)行。③測(cè)序數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)產(chǎn)出即時(shí)分析。④讀長(zhǎng)長(zhǎng)?，F(xiàn)有報(bào)道的最長(zhǎng)測(cè)序讀長(zhǎng)～2.3 Mb［12］。當(dāng)前該平臺(tái)已用于人類血液、尿液和呼吸道樣本里的病毒和細(xì)菌病原體檢測(cè)［7，18-19］，也為西非埃博拉病毒病以及巴西寨卡病毒暴發(fā)疫情的病原確認(rèn)和流行病學(xué)調(diào)查提供了關(guān)鍵線索［5，20-22］。為了驗(yàn)證納米孔測(cè)序技術(shù)在呼吸道病毒病原體應(yīng)急檢測(cè)中的可行性，筆者使用MinION 對(duì)上呼吸道感染患者的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行快速測(cè)序及病原學(xué)分析，并采用PCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

咽拭子標(biāo)本由東部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心于2019年3月在流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行期間采集于某部1 名士兵，該患者因出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、流涕等癥狀就醫(yī)，初步診斷為上呼吸道感染，病原不明。

病毒核酸抽提試劑盒Qiagen QIAamp Min-Elute Virus Spin Kit 購自德國Qiagen 公司，Qubit 3及配套定量試劑耗材、磁力架購自美國Invitrogen公司，cDNA 合成試劑盒NEBNext Ultra II RNA First Strand Synthesis Module 和NEBNext Ultra II Non-Directional RNA Second Strand Synthesis Module 購自美國NEB 公司，AMPure XP 磁珠購自于美國Beckman 公司，快速建庫測(cè)序試劑盒（SQKRADSP4）、測(cè)序芯片制備試劑盒（EXP-FLP001）、測(cè)序芯片（FLO-MIN106，R9.4）、測(cè)序儀MinION Mk1B 購自英國ONT 公司，核酸抽提試劑盒TaKa-Ra MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒One Step Prime-ScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）購自日本Takara 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病毒總核酸抽提及定量

對(duì)用于MinION 測(cè)序的樣本病毒總核酸（DNA/RNA），除不進(jìn)行離心過濾、不加入核酸酶和溶菌酶外，其余實(shí)驗(yàn)步驟均按說明書操作進(jìn)行。收集核酸后，取2 μL 樣本核酸按儀器說明書測(cè)定dsDNA 和RNA 濃度。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 及定量

首先使用NEBNext Ultra II RNA First Strand Synthesis Module 合成cDNA 的第一鏈，然后使用NEBNext Ultra II Non-Directional RNA Second Strand Synthesis Module 合成cDNA 的第二鏈。使用Beckman AMPure XP 磁珠按說明書的方法對(duì)cDNA 產(chǎn)物進(jìn)行純化收集。取1 μL 產(chǎn)物，使用Qubit 3 對(duì)dsDNA 濃度進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量過程按儀器說明書進(jìn)行。

1.2.3 MinION 文庫構(gòu)建及測(cè)序

測(cè)序在MinION Mk1B 測(cè)序儀上進(jìn)行。首先按說明書要求進(jìn)行測(cè)序芯片質(zhì)檢，質(zhì)檢通過后依照快速建庫測(cè)序試劑盒及測(cè)序芯片引發(fā)試劑盒操作流程構(gòu)建測(cè)序文庫并加樣至測(cè)序芯片中，在加樣過程中避免將氣泡引入加樣孔中。在測(cè)序儀控制軟 件MinKNOW（v 3.1.19，ONT 官 網(wǎng)https：//nanoporetech.com/下載）上對(duì)測(cè)序參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，測(cè)序運(yùn)行時(shí)間設(shè)為”48 h”。

1.2.4 MinION 測(cè)序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

使用MinKNOW 實(shí)時(shí)讀取測(cè)序儀產(chǎn)生的fast5文件，使用Albacore 軟件（v 2.3.4，ONT 官網(wǎng)下載）將fast5 文件轉(zhuǎn)換成fastq 文件，堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于7的序列將被剔除。使用Nanoplot 軟件（v 1.22.0）［23］查看測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量及讀長(zhǎng)分布。使用Centrifuge（v 1.0.4）［24］對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行初步比對(duì)分析：將所有通過質(zhì)控的序列與人（Grch38.p12）和病毒參考基因組（NCBI Refseq 數(shù)據(jù)庫ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/，2019年3月21日下載，共計(jì)8 588 個(gè)病毒全基因組序列）進(jìn)行快速比對(duì)，參數(shù)設(shè)置為“--min-hitlen 15-k 5”，3 min 內(nèi)即完成比對(duì)過程。

為進(jìn)一步了解物種構(gòu)成，采取“先比對(duì)后剔除”的策略，先使用Minimap2 軟件（v 2.16）［25］將所有質(zhì)控后序列與人參考基因組比對(duì)，參數(shù)設(shè)置為“-ax map-ont-k 15”，使用samtools（v 1.9）［26］對(duì)比對(duì)產(chǎn)生的sam 文件進(jìn)行處理，得到的未匹配序列用于下一步操作。然后將上步獲得的序列與NCBI病毒參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，參數(shù)為“-ax map-ont -k 7”，獲得的未匹配序列用于下步比對(duì)。最后，將上步未匹配序列使用BLASTN（v 2.8.1）與NCBI 細(xì)菌和古細(xì)菌參考基因組比對(duì)（包括12 668 個(gè)細(xì)菌和283 個(gè)古細(xì)菌全基因組序列，2019年3月21日下載），參數(shù)為“-perc_identity 90-word_size 16-evalue 0.000 001”，未匹配的序列定義為“未分類序列”。

為進(jìn)一步了解比對(duì)詳情，將匹配到NCBI 病毒Refseq 參考數(shù)據(jù)庫的序列提取出來，進(jìn)行在線BLAST 比對(duì)，參數(shù)設(shè)置同上，并挑選出比對(duì)一致性較好的基因組，用于下游分析并統(tǒng)計(jì)比對(duì)情況，包括比對(duì)一致性、查詢序列覆蓋度等信息。使用samtools 及Qualimap（v 2.2.2）［27］計(jì)算參考基因組覆蓋度。使用自有Perl（v 5.22.1）腳本查看序列的產(chǎn)出時(shí)間并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)排序。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 來驗(yàn)證MinION 測(cè)序獲取的病原陽性結(jié)果。Adv7 引物序列：HAdV7-F：5′-GAGGAGCCAGATATTGATATGGAATT-3′，HAdV7-R：5′-AATTGACATTTTCCGTGTAAAGCA-3′ ，探針序列為FAM-AAGCTGCTGACGCTTTTTCGCCTGA-BHQ1。H3N2 引物：H3F：ACCCTCAGTGTGATGGCTTCCAAA，H3R：TAAGGGAGGCATAATCCGGCACAT，探針序列為FAM-ACGCAGCAAAGCCTA CAGCAACTGT -BHQ1。使用無核酸酶的水作為陰性對(duì)照。使用的總核酸從咽拭子病毒保存液中抽提，使用試劑盒配制PCR 反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為42℃5 min，95℃10 s，95℃5 s（40 個(gè)循環(huán)），60℃34 s。Ct 值＜35 時(shí)，認(rèn)為PCR 檢測(cè)陽性。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序概況

樣本抽提后RNA 濃度為20.8 ng/μL，dsDNA濃度為52.0 ng/μL。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后的定量結(jié)果為77.2 ng/μL，以cDNA 作為模板建立MinION文庫并測(cè)序。MinION 運(yùn)行15 h，共產(chǎn)生236 764 條序列（圖1），其中188 063 條序列（占比79.43%）通過數(shù)據(jù)質(zhì)控（高質(zhì)量序列，堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不低于7），其余序列未通過質(zhì)控（低質(zhì)量序列）。

圖1 MinION 測(cè)序通量Figure 1 The sequencing throughput of MinION

通過質(zhì)控的測(cè)序數(shù)據(jù)用于下游生物信息學(xué)分析。其中最長(zhǎng)讀長(zhǎng)為102 326 bp，最短讀長(zhǎng)為23 bp，總堿基數(shù)為246.7 M。平均讀長(zhǎng)為1 311.8 bp，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.1，讀長(zhǎng)中位數(shù)為3 281 bp。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)病原學(xué)分析

快速比對(duì)分析結(jié)果表明樣本中同時(shí)存在兩種呼吸道病原體：人呼吸道腺病毒7 型（DNA 病毒）和甲型流感病毒H3N2 亞型（RNA 病毒）。僅2 min 50 s 即完成比對(duì)過程，獲得初步鑒定結(jié)果。

質(zhì)控后的數(shù)據(jù)中共有145 861 條序列（占比77.56%）來自于人，病毒序列數(shù)為6 876（占比3.66%），細(xì)菌/古細(xì)菌比對(duì)數(shù)為6 057（占比3.22%，主要包括來自口動(dòng)菌屬、奈瑟氏菌屬、鏈球菌屬、普氏菌屬、克雷伯菌屬、梭菌屬、嗜血桿菌屬、韋榮球菌屬等口咽部細(xì)菌），未分類序列數(shù)為29 269（占比15.56%），分類結(jié)果見圖2。

圖2 測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成Figure 2 The composition of sequencing data

進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析同樣在樣本中同時(shí)鑒別出兩種呼吸道病原體：人呼吸道腺病毒7 型和甲型流感病毒H3N2 亞型，分別有19 條和4 條序列比對(duì)到參考基因組。進(jìn)行在線BLAST 比對(duì)后，選取比對(duì)一致性較好的人呼吸道腺病毒7 型（Adv7，Genbank 序列號(hào)：MG696128.1，基因組大小為35 233 bp）和甲型流感病毒H3N2 亞型（H3N2，Genbank 序列號(hào)：MK633737.1-MK633744.1，共8 個(gè)基因區(qū)段，基因組大小分別為1 701 bp、982 bp、1 410 bp、1 497 bp、838 bp、2 151 bp、2 274 bp 和2 280 bp）基因組進(jìn)行下一步分析。

19 條Adv7 序列與參考基因組的比對(duì)一致性介于84.83%和96.55%之間，查詢序列覆蓋度介于70.63%和99.58%之間（表1）。19 條序列中，讀長(zhǎng)排名前三的分別為14 910 bp，14 720 bp 和12 097 bp。對(duì)Adv7 參考基因組覆蓋度為87.65%，覆蓋深度介于1X 和5X 之間（圖3）。4 條H3N2 序列比對(duì)到參考基因組的3 個(gè)區(qū)段上，分別是區(qū)段2（PB1和PB1-F2基因，MK633743.1），區(qū)段3（PA和PA-X基因，MK633742.1）和區(qū)段6（NA 基因，MK633739.1），比對(duì)一致性介于91.43%和94.74%之間，對(duì)3 個(gè)區(qū)段的覆蓋度分別為32.81%，6.79%和7.02%。

至此，鑒定出該患者為呼吸道腺病毒7 型和甲型流感病毒H3N2 亞型混合感染。

2.3 測(cè)序流轉(zhuǎn)時(shí)間

MinION 的文庫制備具有簡(jiǎn)易快速的優(yōu)點(diǎn)，從獲得樣本到建立文庫并上機(jī)測(cè)序，僅用時(shí)約3.5 h（215 min）（圖4）。納米孔測(cè)序技術(shù)還具有實(shí)時(shí)產(chǎn)出數(shù)據(jù)的優(yōu)勢(shì)，測(cè)序開始僅9 s 后即有可用于下游分析的原始數(shù)據(jù)產(chǎn)生。測(cè)序1 h 內(nèi)，共計(jì)產(chǎn)生18 151 條序列，占總產(chǎn)出數(shù)據(jù)的比重為7.67%，其中通過質(zhì)控的序列數(shù)為15 559，占所有可用數(shù)據(jù)的比重為8.27%。測(cè)序開始僅8 min 后，MinION 即產(chǎn)出第1 條Adv7 序列，讀長(zhǎng)為12 097 bp，與MG696128.1 參考序列一致性為90.80%，比對(duì)覆蓋度高達(dá)99.58%（表1）。測(cè)序開始后的9 h 內(nèi)，78.95%的Adv7 序列均已產(chǎn)出，讀長(zhǎng)最長(zhǎng)為14 910 bp。14 h 以后，所有Adv7 序列均已產(chǎn)出。對(duì)于H3N2 數(shù)據(jù)而言，測(cè)序開始69 min 后即產(chǎn)生第1 條序列，9 h 內(nèi)產(chǎn)出所有H3N2 序列。測(cè)序進(jìn)行15 h后終止，進(jìn)行快速宏基因組比對(duì)分析，僅需3 min即獲得微生物初步分類結(jié)果。綜上，從拿到樣本到獲得初步鑒定結(jié)果，共耗時(shí)約18.6 h，低于當(dāng)前二代臺(tái)式測(cè)序平臺(tái)所需時(shí)長(zhǎng)。值得注意的是，測(cè)序開始9 h 內(nèi)，匹配到Adv7 和H3N2 參考基因組的絕大部分序列已經(jīng)產(chǎn)生。此時(shí)終止測(cè)序亦可獲得類似鑒定結(jié)果，因此實(shí)際流轉(zhuǎn)時(shí)間可控制在13 h以內(nèi)。

圖4 MinION 測(cè)序流轉(zhuǎn)時(shí)間Figure 4 The sequencing turnaround time of MinION

2.4 PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

擴(kuò)增曲線表明，Adv7 和H3N2 均為PCR 陽性（圖5）。PCR 結(jié)果與測(cè)序結(jié)果吻合。同時(shí)，對(duì)該份送檢標(biāo)本，未檢出流感網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)的其它呼吸道病原（包括其它亞型甲型流感病毒、乙型流感病毒、支原體、衣原體、冠狀病毒等，數(shù)據(jù)未顯示）。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果Figure 5 The results of real-time fluorescence quantitative PCR

3 討論

作為經(jīng)典、常見的微生物快速檢測(cè)方法，PCR技術(shù)靈敏度和準(zhǔn)確度高，在目標(biāo)微生物參考序列已知的情況下，能在4 個(gè)小時(shí)左右獲得對(duì)單一病原的鑒定結(jié)果。但對(duì)于新發(fā)、未知病原體，由于缺乏病原序列先驗(yàn)知識(shí)，通常需要針對(duì)多種潛在病原設(shè)計(jì)多對(duì)引物，進(jìn)行多輪PCR 進(jìn)行篩查，工作量大且仍有可能無法獲得病原檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)前主流二代測(cè)序平臺(tái)文庫制備流程一般較為繁瑣，測(cè)序周期長(zhǎng)，同時(shí)數(shù)據(jù)分析必須在測(cè)序完成后進(jìn)行，限制其在病原體快速檢測(cè)方面的應(yīng)用。基于納米孔測(cè)序技術(shù)的MinION 能有效解決以上不足，已應(yīng)用于埃博拉病毒病、寨卡病毒病的病原體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中。

呼吸道病毒病原體包括DNA 病毒和RNA 病毒，為了全面捕獲咽拭子保存液里的病毒序列，在病毒種類不明確時(shí)，必須采取病毒DNA 和RNA 同時(shí)測(cè)序的策略，所以，對(duì)于應(yīng)急檢測(cè)的樣本而言，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 這一步必不可少，其耗時(shí)一般在2～3 h。對(duì)于病原體快速測(cè)序而言，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 會(huì)是限速步驟之一，在今后的檢測(cè)過程中，還需探索快速合成cDNA 的實(shí)驗(yàn)方法。

從獲得樣本到建立文庫并上機(jī)測(cè)序，僅用時(shí)約3.5 h，遠(yuǎn)低于當(dāng)前主流二代臺(tái)式測(cè)序平臺(tái)所需的至少6 h 的建庫時(shí)間［28］。從取樣到獲得初步鑒定結(jié)果，MinION 測(cè)序流轉(zhuǎn)時(shí)間約為18.6 h，其中測(cè)序時(shí)長(zhǎng)15 h。對(duì)于培養(yǎng)樣本或者具有病原先驗(yàn)知識(shí)的樣本而言，可以針對(duì)性選擇核酸富集（核酸含量符合建庫要求無需富集、PCR 擴(kuò)增富集DNA 樣本、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA）或文庫制備流程（快速建庫、連接建庫、RNA 直接測(cè)序、cDNA 直接測(cè)序等），測(cè)序儀運(yùn)行時(shí)長(zhǎng)也可針對(duì)性進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)前單個(gè)R9測(cè)序芯片總數(shù)據(jù)產(chǎn)量可達(dá)到10～15 Gb，單個(gè)細(xì)菌或病毒的培養(yǎng)樣本一般測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)量達(dá)到1Gb（細(xì)菌基因組的覆蓋度此時(shí)一般可達(dá)100X-200X）時(shí)，即可考慮終止測(cè)序，測(cè)序耗時(shí)一般不超過5 h，遠(yuǎn)低于本研究中的15 h。而對(duì)于非培養(yǎng)樣本而言，則需要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)產(chǎn)出數(shù)據(jù)，測(cè)序時(shí)長(zhǎng)也會(huì)相應(yīng)增加。本研究中，測(cè)序開始9 h 內(nèi)，匹配到Adv7 和H3N2 參考基因組的絕大部分序列已經(jīng)產(chǎn)生。測(cè)序開始5 h內(nèi)，至少有50%的Adv7 和H3N2 序列已產(chǎn)生。因此，應(yīng)急檢測(cè)的流轉(zhuǎn)時(shí)間還有望進(jìn)一步減少。

本文使用一步法RT-PCR 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證?？梢园l(fā)現(xiàn)Ct 值與匹配序列數(shù)目和數(shù)據(jù)產(chǎn)出時(shí)間具有一定相關(guān)性。Ct 值越小，核酸含量相對(duì)越高，匹配到參考基因組的序列就越多，其數(shù)據(jù)產(chǎn)生的時(shí)間越早；反之，匹配到參考基因組的序列則越少，數(shù)據(jù)產(chǎn)出時(shí)間越晚。

本文的研究結(jié)果表明，MinION 用于呼吸道病原體的快速檢測(cè)具有可行性，且具備同時(shí)檢測(cè)多種病原體并對(duì)病原分型的能力，但仍有一些技術(shù)問題需要解決，如在快速檢測(cè)背景下，人的臨床樣本，尤其是咽拭子、血液、尿液等樣本，其宿主核酸含量占比一般較高，病原體核酸含量極低，這就導(dǎo)致測(cè)序數(shù)據(jù)中宿主相關(guān)序列占絕大部分。如何有效地富集病原體核酸將會(huì)是該技術(shù)應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需要解決的重難點(diǎn)問題。筆者相信，隨著納米孔測(cè)序技術(shù)及相關(guān)試劑的升級(jí)完善，MinION 有潛力成為病原體快速檢測(cè)和臨床診斷的常規(guī)工具。