白藜蘆醇抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細胞分化的作用和機制

丁玉紅，姚陡奇，郭秀穎

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部 皮膚科，吉林 長春130031)

白藜蘆醇(resveratrol,Res) 是一種廣泛存在的非黃酮類多酚化合物，主要是從葡萄、桑葚、虎杖等提取出來的，是許多中藥的主要成分[1]，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒以及調(diào)節(jié)細胞代謝等多種生物學(xué)功能，目前在人體健康領(lǐng)域和動物生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用[2]。

心肌梗死、心臟瓣膜病、高血壓等是老年人的常見以及高發(fā)疾病，而心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是這類疾病影響心臟功能的常見病理性改變。目前認為MF是由細胞外基質(zhì)代謝異常而過度沉積導(dǎo)致的[3,4]。大量研究證明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活占據(jù)MF的主導(dǎo)地位，其中血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)可誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生[5]。近年來發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smads信號通路也與MF密切相關(guān)[6]。TGF-β1是TGF-β家族中強致纖因子，它可以趨化并誘導(dǎo)心肌成纖維細胞分化成肌纖維細胞，合成細胞外基質(zhì)(ECM)并與細胞因子或者炎性因子反應(yīng)；也可以直接刺激膠原蛋白等因子的表達，促進ECM的合成并且抑制其降解，進而導(dǎo)致ECM過度沉積，促使心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展[7]。

白藜蘆醇對心血管疾病有很多保護作用[8]，但目前尚未明確其抗MF的相關(guān)機制。因此，本實驗擬在離體培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細胞(RDFs)上，觀察Res 對AngⅡ 刺激RDFs增殖和分化的抑制作用，并探討Res改善纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

白藜蘆醇購自上海晶純生化科技股份有限公司。大鼠心肌成纖維細胞系(RDFs)購于美國模式培養(yǎng)物保藏所 (ATCC,美國)。胰酶、青霉素鏈霉素雙抗及DMSO購自美國invitrogen 公司。I型膠原蛋白(Collagen I)和Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)測定試劑盒購自南京建成公司。血管緊張素Ⅱ購自美國Sigma公司。抗體PCNA、GAPDH購自CST公司；抗體a-SMA、TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3和Smad7購自abcam公司。BCA 蛋白定量試劑盒購自北京碧橙藍科技有限公司。余為市售分析純產(chǎn)品。

1.2 儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific 公司； 超凈工作臺購自上海智成分析儀器制造有限公司；高速低溫離心機(湖南湘儀公司)；超純水儀購自美國Merck Millipore 公司；X線膠片(樂凱公司)；電子分析天平(德國賽多利斯公司)；PVDF轉(zhuǎn)移膜(GE Healthcare公司，0.42 μm)。

1.3 大鼠心肌成纖維細胞RDFs的培養(yǎng)

RDFs培養(yǎng)于成纖維細胞培養(yǎng)基(Fibroblast medium,FM)中，含 1 %成纖維細胞生長因子、10 %胎牛血清和 100 U/mL 青霉素和鏈霉素。培養(yǎng)箱溫度 37 °C，95 %空氣混合 5% CO2。每 48 小時更換一次培養(yǎng)基。

1.4 細胞實驗分組

培養(yǎng)RDFs融合度達到85%-90%，將細胞的培養(yǎng)基更換成不含成纖維細胞生長的培養(yǎng)基，然后將細胞分為三組：對照組、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)組和Res組。AngⅡ組:培養(yǎng)基中加入AngⅡ(終濃度為1 μmol/L)，孵育細胞至24 h；Res組：培養(yǎng)基中同時加入AngⅡ(終濃度為1 μmol/L)和白藜蘆醇(終濃度為25 μmol/L)，共同孵育細胞至24 h；對照組：加入同等體積的PBS，孵育細胞至24 h。

1.5 大鼠成纖維細胞RDFs培養(yǎng)基中膠原蛋白collagen I和 collagen Ⅲ含量測定

三組細胞培養(yǎng)24 h 后，收集培養(yǎng)基，按照說明書，分別用ELISA試劑盒檢測collagen I和 collagen Ⅲ含量。在酶標儀上設(shè)置450 nm波長測量各孔吸光度并計算最終濃度。

1.6 Western blot 法檢測蛋白表達

三組細胞培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS 洗3 遍，加入200 μl 細胞裂解液RIPA(含蛋白酶抑制劑)，超聲破碎細胞，提取蛋白樣品。SDS-PAGE 電泳分離蛋白，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1 h 后，分別加入一抗，PCNA(1∶2 000)、α-SMA (1∶2 000)、TGF-β1(1∶1 000)、TGF-βRⅡ(1∶1 000)、Smad3(1∶1000)、Smad7(1∶1000)和 GADPH(1∶4000)，4℃孵育過夜，TBST洗3次，加入相應(yīng)的二抗(1∶5000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，ECL顯色，用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行掃描分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠成纖維細胞RDFs中PCNA的表達

PCNA作為細胞增殖狀態(tài)的指標。本研究觀察到，與對照組相比，Ang Ⅱ 可誘導(dǎo)RDFs中的PCNA蛋白水平明顯增加 (P<0.05)，提示Ang Ⅱ可誘導(dǎo)RDFs增殖；而給予Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)RDFs中PCNA蛋白水平的增加(P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs增殖，如圖1所示。

圖1 Res對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠成纖維細胞RDFs中PCNA的表達的影響

2.2 Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs中α-SMA含量增加

α-SMA是成纖維細胞活化為肌成纖維細胞的標志，本研究觀察到，與對照組相比，Ang Ⅱ 可誘導(dǎo)RDFs中的α-SMA蛋白水平明顯增加 (P<0.05)，提示Ang Ⅱ可誘導(dǎo)RDFs發(fā)生分化；而給予Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)RDFs中α-SMA蛋白水平的增加 (P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs發(fā)生分化，見圖2。

2.3 Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs培養(yǎng)基中膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ含量增加

肌成纖維細胞可以分泌合成細胞外基質(zhì)，細胞外基質(zhì)以膠原蛋白collagen I和 collagen Ⅲ為主。本研究觀察到，與對照組相比，Ang Ⅱ 可誘導(dǎo)RDFs培養(yǎng)基中的collagen I和 collagen Ⅲ含量明顯增加 (P<0.05)；而Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)RDFs中collagen I和 collagen Ⅲ含量增加 (P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs分泌膠原，見圖3。

圖2 Res對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠成纖維細胞RDFs中α-SMA的表達的影響

圖3 Res對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠成纖維細胞RDFs中膠原蛋白collagen I和 collagen Ⅲ含量的表達的影響

2.4 Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3含量增加及Smad7含量降低

TGF-β1/Smads信號通路與MF 密切相關(guān)。本研究觀察到，與對照組相比，Ang Ⅱ 可誘導(dǎo)RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3含量增加，降低Smad7含量 (P<0.05)；而給予Res可以明顯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3含量增加，抑制Smad7含量降低 (P<0.05)，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs中TGF-β1/Smads信號通路的活化，從而抑制纖維化。見圖4。

圖4 Res對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs中TGF-β1、TGF-βRⅡ、Smad3和Smad7含量的影響

3 討論

心肌纖維化導(dǎo)致的并發(fā)癥已成為心血管疾病死亡的主要原因。心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展與心肌成纖維細胞增殖、分化和分泌膠原有著緊密的聯(lián)系[9,10]。白藜蘆醇對心血管疾病有很明顯的保護作用[8]，但目前尚未明確其抗MF的作用及相關(guān)機制。本實驗發(fā)現(xiàn)用Ang Ⅱ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RDFs 24 h后,RDFs中PCNA和α-SMA蛋白水平增多， TGF-β1、膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ明顯增加，并且TGF-βRⅡ和Smad3蛋白水平增加，Smad7蛋白水平降低，提示Ang Ⅱ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RDFs增殖和分化、促進RDFs分泌膠原和活化TGF-β1/Smads信號通路促進纖維化；而給予白藜蘆醇可明顯改善Ang Ⅱ誘導(dǎo)的上述指標變化，提示白藜蘆醇可以抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs發(fā)生纖維化。

心肌的成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，后者具有平滑肌細胞和CFs雙重功能，能夠合成細胞外基質(zhì)，以膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ為主，并與TNF-α、TGF-β1等細胞因子發(fā)生反應(yīng)，加速心肌纖維化的進程，促進心肌纖維化的形成[11]。α-SMA 是肌成纖維細胞的標志物[12]。PCNA作為細胞增殖狀態(tài)的指標[13]。本研究發(fā)現(xiàn) Res可以明顯降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)RDFs中α-SMA和PCNA的蛋白水平增加，抑制膠原蛋白collagen I和collagen Ⅲ的含量，提示Res可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的RDFs增殖和分化，并且抑制纖維化。

TGF-β1是目前已知的最強的促纖維化因子之一。TGF-β1/Smads信號通路上調(diào)可以促進心肌成纖維細胞增殖，并促進其分化為心肌成纖維細胞，從而促進膠原的含量增多，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的積聚，促進心肌發(fā)生纖維化。以往的研究已經(jīng)證實了 TGF-β1 與成纖維細胞[14]或周細胞[15]膜上的TGFβRⅡ 結(jié)合，形成復(fù)合體，活化 Smad2/3，轉(zhuǎn)位到細胞核中，啟動膠原合成相關(guān)的基因，產(chǎn)生前體膠原蛋白和纖維合成相關(guān)蛋白，促進心肌間質(zhì)的I型和Ⅲ型膠原蛋白的沉積[16]。Smads 蛋白可以分為受體調(diào)節(jié) Smads 蛋白、共同介質(zhì)型 Smads 蛋白和抑制性 Smads 蛋白。Smad2/3 是受體調(diào)節(jié) Smads 蛋白，與受體結(jié)合后，可上調(diào) TGF-β1 信號通路相關(guān)蛋白的表達；Smad7 是抑制性 Smads 蛋白，阻止受體調(diào)節(jié) Smads 蛋白磷酸化，從而阻斷 TGF-β1信號通路效應(yīng)[17]。Smad7抑制TGFβ1信號通路的作用發(fā)揮在損傷后的早期階段，過表達Smad7可抑制TGFβ1介導(dǎo)的纖維化[18]。本研究結(jié)果顯示，Res可以明顯下調(diào)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的TGF-β1含量增加、下調(diào)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的TGF-βRⅡ和Smad3蛋白含量增加、改善Ang Ⅱ誘導(dǎo)的Smad7的蛋白含量的降低，提示Res通過抑制Ang Ⅱ激活的TGF-β1/Smads信號通路，從而發(fā)揮抑制纖維化的作用。

綜上所述，Res抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)心肌成纖維細胞增殖和分化及纖維化的作用機制可能與其抑制心肌成纖維細胞的增殖和分化，下調(diào)I型和Ⅲ型膠原蛋白含量、抑制TGF-β1/Smads信號通路活化從而抑制纖維化有關(guān)，為臨床解決纖維化等相關(guān)疾病的應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。