劉 敩,王 晶,張 輝,方宏艷
(吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長春130041)
顯著性地區(qū)差異是喉癌的流行病學(xué)特征,我國東北地區(qū)為喉癌高發(fā)區(qū),并且呈逐年升高趨勢[1]。目前喉癌治療主要以手術(shù)治療為主,同時輔以化療放療,內(nèi)分泌治療等。研究發(fā)現(xiàn),天然植物中的生物堿具有明顯的抗腫瘤功效[2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤生物堿包括小檗堿、長春新堿、喜樹堿、苦參堿、紫杉醇等生物堿,本研究以人喉癌細胞株(Hep-2細胞)為靶系統(tǒng)體外觀察苦參堿對Hep-2細胞增殖周期及誘導(dǎo)凋亡的影響。
1.1 材料人喉癌細胞株由吉林省腫瘤研究所饋贈。RPMI1640培養(yǎng)基,四甲基偶氮唑藍(MTT試劑)購自美國sigma公司,苦參生物堿注射液購自上海伊幫醫(yī)藥信息有限公司。
1.2 方法MTT比色法檢測Hep-2細胞增殖抑制率,流式細胞術(shù)檢測Hep-2細胞周期進程變化,參照文獻[3]進行。苦參堿誘導(dǎo)Hep-2細胞凋亡率檢測采用吖啶橙吸收法。
2.1不同濃度苦參堿對Hep-2細胞增殖抑制率具有一定的劑量依賴性,組間比較差異顯著,見表1。
表1 不同濃度苦參堿制劑對Hep-2細胞增殖抑制率
2.2不同濃度苦參堿制劑對Hep-2細胞周期進程影響,可見G0/G1期細胞增多,S期細胞減少,G2/M期細胞相對增多,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表2。
表2 不同濃度苦參堿制劑對Hep-2細胞周期進程影響
2.3 熒光染色結(jié)果不同濃度苦參堿制劑對Hep-2細胞均有促凋亡作用,4 mg/ml、8 mg/ml苦參堿制劑作用于Hep-2細胞凋亡率升高分別為(29.4±4.3)%和(42.8±4.7)%,見圖1-3。
圖1 0 mg/ml 苦參堿誘導(dǎo)Hep-2細胞熒光染色圖400× 圖2 4 mg/ml 苦參堿誘導(dǎo)Hep-2細胞熒光染色圖100× 圖3 8 mg/ml 苦參堿誘導(dǎo)Hep-2細胞熒光染色圖100×
苦參堿作為中藥苦參的萃取物,臨床上用于殺蟲、抗炎、抗過敏等常用藥。近年來研究表明,苦參堿具有抗腫瘤、抗新生血管生成等特殊作用。體外實驗證明,苦參堿對肝癌、胃癌、肺癌等腫瘤細胞均有明顯的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用[3],且對正常細胞無影響。本研究以Hep-2細胞為靶點。觀察不同濃度苦參堿對其生物學(xué)作用機制,結(jié)果表明,MTT法檢測不同濃度苦參堿制劑對Hep-2細胞的增殖抑制率,0 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml組分別為2.1%、18.1%、26.3%和44.9%,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義,且苦參堿對人Hep-2細胞的增殖抑制作用具有一定的劑量依賴性。
流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,不同濃度的苦參堿制劑作用Hep-2細胞24小時后均能顯著提高G0/G1期細胞比例。而S期細胞比例減少,從而使G2/M期細胞相對增多,細胞周期間比例失衡。G0/G1期細胞阻滯不能順利進入S期,故S期細胞減少。同時G0/G1期細胞也是各種化療藥物作用的敏感點[4],G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反應(yīng),G2/M期也是細胞進入有絲分裂前最后一道關(guān)卡[5],臨床上多種治療手段都會使腫瘤細胞具有選擇性的停滯于該期。此外,本研究應(yīng)用免疫熒光技術(shù),對不同濃度的苦參堿制劑誘導(dǎo)Hep-2細胞凋亡機制的探討,結(jié)果表明,BB(溴化乙啶)為啡啶類染料可嵌入多核苷酸結(jié)構(gòu),活細胞膜可排斥BB穿透,而凋亡細胞和死亡細胞極易穿透,故凋亡細胞被染成黃色。死亡細胞則呈均勻紅色,而AO(吖啶橙),可穿透活細胞膜,細胞被染成綠色,通過熒光顯微鏡極易區(qū)別。
綜上所述,苦參生物堿抗腫瘤機制與干擾腫瘤細胞周期進程,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤新生血管生成和多藥耐藥等有關(guān)。