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    抑制COX-2表達(dá)對(duì)心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中心肌細(xì)胞保護(hù)作用的研究

    2020-03-26 11:51:58麻海春
    關(guān)鍵詞:水平檢測(cè)

    賈 丹,張 媛,連 鑫,龐 磊,麻海春,姜 曦

    (吉林大學(xué)第一醫(yī)院 1.泌尿外二科;2.麻醉科;3.健康管理中心,吉林 長(zhǎng)春130021)

    研究表明在缺氧缺血的心肌細(xì)胞中,環(huán)氧化酶(COX-2)呈高水平表達(dá),且其表達(dá)水平直接影響心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡的嚴(yán)重程度[1-3]。雖然介導(dǎo)心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷(MI/RI)的分子機(jī)制尚未完全明了,但MI/RI過(guò)程可能涉及眾多潛在的病理生理學(xué)機(jī)制,例如細(xì)胞凋亡的激活、活性氧(ROS)的形成,以及炎癥反應(yīng)等。本研究通過(guò)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)進(jìn)行缺氧/復(fù)氧(H/R)實(shí)驗(yàn),研究MI/RI過(guò)程中,COX-2表達(dá)水平與細(xì)胞損傷之間潛在的因果聯(lián)系與分子基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)分組

    將大鼠心肌細(xì)胞H9C2(ATCC公司,美國(guó))隨機(jī)分為三組:對(duì)照組(CTL)、缺氧/復(fù)氧組(H/R)和給藥組[H/R+10 μM Helenalin(H/R+H),或H/R+10 μM NS398(H/R+N)][4],細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[5]。

    1.2 細(xì)胞活力檢測(cè)

    采用乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測(cè)試劑盒(Roche公司,德國(guó))檢測(cè)不同組別細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH的活性,判定各組細(xì)胞損傷的程度[6]。

    1.3 免疫印跡試驗(yàn)

    采用免疫印跡方法對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)所需抗體及其稀釋倍數(shù)分別為:COX-2(1∶1000)、β-action(1∶1000)、IκBα(1∶1000)、p-IκBα(1∶1000)、p65(1∶1000)、p-p65(1∶1000)。實(shí)驗(yàn)所需抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。采用Image J軟件對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

    1.4 COX-2活性分析

    采用COX活性檢測(cè)試劑盒(Cayman,美國(guó)),通過(guò)熒光法對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的COX-2活性進(jìn)行檢測(cè)。

    1.5 ROS含量測(cè)定

    分別將各組細(xì)胞接種在96孔板上,對(duì)其進(jìn)行不同組別的預(yù)處理,然后用二氫乙錠孵育細(xì)胞,收集細(xì)胞并檢測(cè)熒光,評(píng)估細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

    1.6 實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)分析

    提取并收集各組細(xì)胞中的mRNA,取等量不同組別的mRNA進(jìn)行qPCR,反應(yīng)條件如下:95℃變性30 s,95℃擴(kuò)增6 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán),60℃30 s。選取同一樣本中的β-actin作為內(nèi)參,對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。引物序列詳見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。

    1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    本研究采用SPSS21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,使用GraphPad Prism 5.0軟件做圖,采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較,組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05時(shí),差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 NFκB的激活介導(dǎo)H/R過(guò)程中COX-2表達(dá)上調(diào)

    H/R能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生損傷,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在受到H/R刺激后,COX-2表達(dá)水平上升,LDH釋放量明顯高于對(duì)照組細(xì)胞;而加入NFκB抑制劑Helenalin處理后,COX-2水平下降,心肌細(xì)胞的LDH釋放量下降(圖1)。

    圖1 H/R誘導(dǎo)后,各組細(xì)胞LDH釋放水平差異

    在H9C2細(xì)胞受到H/R刺激后,伴隨COX-2升高的同時(shí),IκBα降解增強(qiáng),IκBα水平下降,IκBα和p65的磷酸化增強(qiáng);Helenalin能夠有效抑制上述變化(圖2)。

    2.2 抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導(dǎo)的促炎癥因子轉(zhuǎn)錄

    與對(duì)照組相比,H/R刺激選擇性地誘導(dǎo)白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNFα)的mRNA表達(dá),而不影響白介素-1β(IL-1β);給予COX-2選擇性抑制劑NS398可顯著抑制IL-6和TNFα的高表達(dá)(圖3)。

    2.3 抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS活性

    在細(xì)胞受到H/R刺激后,與對(duì)照組相比,H/R組中ROS活性明顯升高;然而,這種H/R誘導(dǎo)的ROS活性增加能夠被COX2選擇性抑制劑NS398顯著抑制(圖4)。

    3 討論

    一直以來(lái),COX-2被認(rèn)為與炎癥反應(yīng)息息相關(guān),包括血管舒張、組織水腫和疼痛[8],有研究顯示,COX-2的效應(yīng)蛋白前列腺素在MI/RI炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[9]。前期研究顯示,抑制COX-2將通過(guò)Akt/iNOS/NO信號(hào)通路保護(hù)心肌細(xì)胞免受凋亡的影響[6]。

    研究中發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在受到H/R刺激時(shí),伴隨COX-2升高的同時(shí),IκBα降解增加,IκBα和p65的磷酸化增強(qiáng),以上結(jié)果均提示NFκB蛋白被激活[10]。為了檢測(cè)在H/R過(guò)程中心肌細(xì)胞中COX-2的誘導(dǎo)是否由NFκB介導(dǎo),我們采用NFκB選擇性抑制劑Helenalin對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。抑制劑預(yù)處理顯著抑制了H/R所導(dǎo)致的COX-2誘導(dǎo),提示H/R過(guò)程中COX-2表達(dá)上調(diào)由激活的NFκB介導(dǎo)。

    圖2 受到H/R刺激后,各組細(xì)胞中不同蛋白的表達(dá)水平變化及量化分析

    圖3 H/R后,各組細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNFα的mRNA表達(dá)水平及量化分析

    圖4 H/R后,各組細(xì)胞中ROS活性量化分析

    缺氧能夠誘發(fā)心肌細(xì)胞發(fā)生無(wú)菌性炎癥,大量炎癥因子釋放,細(xì)胞趨化、浸潤(rùn)對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷,導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡以及隨后的心功能障礙[11]。本研究發(fā)現(xiàn),H/R刺激選擇性地誘導(dǎo)心肌細(xì)胞IL-6和TNFα的mRNA表達(dá),二者是已知與促凋亡作用相關(guān)的炎癥因子[12,13]。TNFα是經(jīng)典NFκB信號(hào)通路的重要激活因子[14],當(dāng)其轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)時(shí),能夠激活NFκB表達(dá),并進(jìn)一步介導(dǎo)COX-2表達(dá),造成心肌細(xì)胞損傷。COX-2選擇性抑制劑NS398能夠顯著抑制H/R介導(dǎo)的IL-6和TNFα轉(zhuǎn)錄水平變化,提示抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導(dǎo)的促炎癥因子轉(zhuǎn)錄,從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。然而,對(duì)COX-2活性進(jìn)行選擇性抑制后,IL-6和TNFα的mRNA水平下調(diào)的分子機(jī)制尚不清楚,值得進(jìn)一步研究和探討。

    MI/RI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,涉及眾多病理生理因素的相互關(guān)聯(lián),ROS聚集被認(rèn)為是導(dǎo)致MI/RI的重要原因之一[15]。在生理狀態(tài)下,體內(nèi)的ROS通過(guò)多種細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的代謝活動(dòng)產(chǎn)生,ROS水平處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[16]。而在心肌缺血狀態(tài)下,COX-2被活化,在其催化前列腺素合成的過(guò)程中有大量ROS產(chǎn)生[17],并促進(jìn)了心肌損傷進(jìn)一步加劇[15]。此外,過(guò)量的ROS產(chǎn)生還能夠打破NOS與NO之間的動(dòng)態(tài)平衡,并影響NO的生物利用度[18]。有研究顯示,在MI/RI過(guò)程中,減少心肌細(xì)胞中ROS的形成,能夠在心臟組織中產(chǎn)生更高的NO含量,并縮小梗死面積[19,20]。本研究中我們發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞受到H/R刺激后,ROS活性明顯上升,而這一現(xiàn)象能夠被COX-2選擇性抑制劑NS398顯著抑制。這些證據(jù)表明,抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS活性,減輕細(xì)胞損傷。

    目前,COX-2選擇性抑制劑廣泛應(yīng)用于缺血性心臟病的治療,進(jìn)一步了解COX-2如何影響心肌細(xì)胞凋亡可能具有深遠(yuǎn)的臨床意義。本研究的結(jié)果證實(shí),在心肌細(xì)胞受到缺氧刺激時(shí),NFκB的激活誘導(dǎo)COX-2表達(dá)上調(diào),抑制COX-2活性能夠降低H/R誘導(dǎo)的促炎癥因子轉(zhuǎn)錄以及ROS活性增強(qiáng),從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

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