骨肉瘤患者的血漿長鏈非編碼RNA UCA1表達及臨床意義分析

井鴻雁，黃 斌，王 微

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033)

骨肉瘤是臨床上最常見的骨組織原發(fā)惡性腫瘤之一，約占全部骨腫瘤的20%，也是兒童和青少年的常見惡性腫瘤。骨肉瘤具有進展快、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)的臨床特點，通常以疼痛、腫塊、跛行等為主要表現(xiàn)，目前針對骨肉瘤的治療以手術(shù)和化療為主[1]，患者的預(yù)后與其臨床分期具有密切的關(guān)系，非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的術(shù)后5年存活率為50%-70%，而轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的術(shù)后5年存活率僅為15%-30%[2]，因此，提高對早期骨肉瘤的診斷效率是改善患者預(yù)后的重要手段。隨著分子生物學研究的不斷深入，針對骨肉瘤的基因?qū)用嫜芯恳阎饾u從蛋白質(zhì)編碼基因拓展至非蛋白質(zhì)編碼基因，長鏈非編碼RNA(lncRNA)主要功能是對染色體發(fā)揮修飾作用，并在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個層面發(fā)揮調(diào)控作用[3]，能夠直接參與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等病理過程[4]。學者們已發(fā)現(xiàn)多種lncRNA通過復(fù)雜的機制參與了骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展，并介導(dǎo)其侵襲轉(zhuǎn)移過程[5]。近年來，一些研究者開始嘗試應(yīng)用外周血lncRNA表達水平作為診斷骨組織惡性腫瘤的生物學標志物，取得了一定的進展[6]。尿路上皮癌胚抗原1(UCA1)是一種在胚胎組織中普遍表達的lncRNA，而在成人僅有心臟和脾臟組織有少量表達，在多種腫瘤組織中均可觀察到lncRNA UCA1的過表達，且其表達水平與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移行為有關(guān)，本文針對骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1表達及臨床意義進行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究資料

連續(xù)選取2017年6月-2019年6月在吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院住院治療、符合本研究入選標準的194例骨腫瘤患者作為病例組，其中，118例骨肉瘤患者為惡性組，76例良性骨腫瘤患者為良性組，選取同期100例接受體檢者作為對照組，對三組研究對象的血漿lncRNA UCA1相對表達量進行檢測和分析，所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.1.1納入標準 病例組患者均符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)制訂的《骨腫瘤臨床指南(2017年版)》中的骨肉瘤和良性骨腫瘤診斷標準[7]，均經(jīng)術(shù)前穿刺活檢或術(shù)后病理檢查確診。所有患者均為初診初治病例，臨床資料完整。對照組研究對象均經(jīng)臨床檢查排除骨腫瘤。

1.1.2排除標準 合并有其它部位原發(fā)惡性腫瘤、骨及重要器官畸形、心肺肝腎等重要器官功能不全、血液系統(tǒng)疾病、心腦血管卒中者；入院前已接受抗腫瘤治療的患者；妊娠期或哺乳期患者。

1.2 觀察指標

1.2.1一般資料調(diào)查 對所有研究對象的年齡和性別進行統(tǒng)計調(diào)查；對惡性組患者臨床分期、腫瘤位置、遠處轉(zhuǎn)移情況進行統(tǒng)計調(diào)查；對良性組患者的腫瘤種類、腫瘤位置進行統(tǒng)計調(diào)查。

1.2.2血漿lncRNA UCA1相對表達量檢測 病例組于入院次日采集空腹外周靜脈血樣本4 ml，對照組研究對象于體檢當日采集空腹外周靜脈血樣本4 ml，經(jīng)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝處理后，血樣經(jīng)3 000 r/min離心15 min后以微量取樣器吸取血漿，移入1.5 ml EP管置于-20℃冰箱中保存待測。檢測時將血漿樣品置于冰上融化，吸取250 μl血漿樣品，以Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)提取總RNA，以20 μl反應(yīng)體系進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以U6為內(nèi)參、采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(q-PCR)檢測lncRNA UCA1相對表達量，引物序列及反應(yīng)體系見表1、表2。反應(yīng)程序為：起始模板變性95℃ 1 min，PCR模板變性95℃ 20 s，退火、延伸61℃ 31 s，連續(xù)反應(yīng)45次。計算內(nèi)參標準品與待測樣品的循環(huán)閾值(Ct值)，以2-ΔΔCt計算lncRNA UCA1相對表達量，每個樣品重復(fù)檢測3次取平均值作為最終測量值。

表1 q-PCR反應(yīng)引物序列

表2 q-PCR反應(yīng)體系

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 三組研究對象的一般資料情況

三組研究對象在年齡、性別構(gòu)成方面的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，惡性組與良性組患者在腫瘤位置、腫瘤大小方面的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 三組研究對象的一般資料情況對比

2.2 三組研究對象血漿lncRNA UCA1相對表達量的比較

三組研究對象血漿lncRNA UCA1相對表達量的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中，惡性組患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量高于良性組或?qū)φ战M，良性組患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量高于對照組，各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

2.3 不同臨床特征骨肉瘤患者血漿lncRNA UCA1相對表達量的對比

在惡性組中，臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量高于臨床分期為Ⅰ-Ⅱ期的患者，出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量高于未出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表4 三組研究對象血漿lncRNA UCA1相對表達量的比較

表5 不同臨床特征骨肉瘤患者血漿lncRNA UCA1相對表達量的對比

2.4 血漿lncRNA UCA1相對表達量診斷骨肉瘤的價值分析

血漿lncRNA UCA1相對表達量在骨肉瘤診斷、骨肉瘤與良性骨腫瘤鑒別診斷、Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤診斷及骨肉瘤伴遠處轉(zhuǎn)移診斷中的AUC分別為0.854、0.876、0.711、0.719，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在Cutoff值下，血漿lncRNA UCA1相對表達量在骨肉瘤診斷、骨肉瘤與良性骨腫瘤鑒別診斷中的靈敏度分別為0.727、0.661，特異度均達到了1.000，在Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤診斷、骨肉瘤伴遠處轉(zhuǎn)移診斷中的靈敏度分別為0.852、0.870，特異度分別為0.626、0.568。見表6、圖1。

表6 血漿lncRNA UCA1相對表達量診斷骨腫瘤及骨肉瘤的ROC曲線分析

注：(A)診斷骨肉瘤的ROC曲線分析;(B)鑒別診斷骨肉瘤與良性骨腫瘤的ROC曲線;(C)診斷Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤的ROC曲線;(D)診斷骨肉瘤伴遠處轉(zhuǎn)移的ROC曲線

3 討論

本研究結(jié)果顯示，與健康人群相比，骨腫瘤患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量較高，特別是骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量出現(xiàn)了顯著上調(diào)，血漿lncRNA UCA1相對表達量能夠作為骨腫瘤診斷和良性骨腫瘤與骨肉瘤鑒別診斷的輔助指標。近年來，僅有一項研究[8]針對骨肉瘤血循環(huán)中的lncRNA UCA1表達量進行了分析，該研究結(jié)果顯示，骨肉瘤患者的外周血lncRNA UCA1表達上調(diào)，在診斷骨肉瘤中的AUC為0.831，這與本研究結(jié)果基本一致，且該研究結(jié)果還顯示，高表達水平的lncRNA UCA1與較低的總生存率和無病生存率相關(guān)，是預(yù)測患者預(yù)后不良的獨立指標，但是，該研究選取的檢測材料為血清樣本，而且對照組僅為健康人群，與本研究設(shè)計方案存在一定的差異。筆者認為，骨肉瘤患者血漿lncRNA UCA1表達上調(diào)可能與腫瘤細胞中l(wèi)ncRNA UCA1過表達有關(guān)，在腫瘤細胞凋亡過程中，其細胞漿物質(zhì)通過局部血液循環(huán)進入體循環(huán)。相關(guān)研究[9]已證實，lncRNA UCA1在骨肉瘤組織和細胞系中存在明顯的表達上調(diào)，且其高表達與腫瘤大小、腫瘤分級、遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期等臨床特征密切相關(guān)，在敲除抑制lncRNA UCA1基因后，骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移受到抑制，細胞凋亡加快。通過細胞定位和組織表達譜分析，UCA1基因主要定位于癌細胞的細胞漿，其表達水平要明顯高于癌旁組織，雖然腫瘤患者體液中的lncRNA UCA1表達水平一般遠遠低于腫瘤組織，但仍然可觀察到患者體液樣本中l(wèi)ncRNA UCA1表達水平的異常上升，比較典型的例子是，相關(guān)研究[10]已證實，膀胱癌患者尿液中的lncRNA UCA1表達水平可用于膀胱癌的診斷，不僅具有較高的敏感性和特異性，而且結(jié)果穩(wěn)定性也較好；此外，針對肝細胞癌、食管鱗癌患者血清lncRNA UCA1表達的研究[11,12]也得出相似的結(jié)論。因此，針對具有骨腫瘤癥狀的患者，在應(yīng)用影像學手段的同時，針對其外周血lncRNA UCA1表達量進行檢測，能夠為疾病的鑒別診斷提供一種無創(chuàng)性的參考指標，從而為考慮是否采用進一步的有創(chuàng)診斷手段提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期及出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1相對表達量上調(diào)更加顯著，其水平可輔助診斷骨肉瘤臨床分期、遠處轉(zhuǎn)移等，這提示了lncRNA UCA1的過表達可能與骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學行為有關(guān)，血漿lncRNA UCA1相對表達量能夠作為預(yù)測骨肉瘤疾病進展程度的輔助指標。近年來，研究者針對lncRNA UCA1的促癌機制進行了大量研究[13,14]，發(fā)現(xiàn)了lncRNA UCA1在促進腫瘤細胞生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、化療耐藥等多種惡性表型方面均發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，作為一種競爭性內(nèi)源RNA，lncRNA UCA1主要通過作用于染色質(zhì)修飾體、對染色體成環(huán)進行調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)化為微小RNA(miRNA)、吸附miRNA等機制，在表觀遺傳學水平上對靶基因發(fā)揮間接調(diào)節(jié)作用，從而參與了腫瘤病理過程的調(diào)控。通過對非小細胞肺癌、黑色素瘤、咽鱗狀細胞癌等的基礎(chǔ)醫(yī)學研究[15-17]，研究者已發(fā)現(xiàn)了lncRNA UCA1可對miRNA-185-5p、miRNA-582-5p、miRNA-143、p21等下游基因和β-Catenin等分子通路發(fā)揮調(diào)控作用從而發(fā)揮促癌作用，主要表現(xiàn)為抑制腫瘤細胞的凋亡并上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶、Ki67等侵襲相關(guān)蛋白的表達。此外，進一步的研究[18]還證實，外源性加入lncRNA UCA1可促進癌細胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量的提升，增強癌細胞的生存及運動能力，從而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。而在針對骨肉瘤的研究[19-21]中，研究者也發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織可通過表達C-C基序趨化因子配體18、低氧誘導(dǎo)因子-1α等誘導(dǎo)lncRNA UCA1的表達，而lncRNA UCA1能夠通過調(diào)控miRNA-582及影響PI3K/AKT/mTOR、PTEN/AKT、Wnt/β-catenin等信號通路，促進上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程，從而促進骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移，最終促進了腫瘤的進展和遠處轉(zhuǎn)移。由于骨肉瘤具有早期轉(zhuǎn)移快、化療易耐藥的特點，故中晚期或出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后通常較差，因此，臨床醫(yī)生應(yīng)充分發(fā)揮lncRNA UCA1等遺傳學指標的作用，努力提高對早期骨肉瘤的診斷效率，對遠處轉(zhuǎn)移等進行充分的預(yù)測，從而達到改善患者預(yù)后的目的。

值得提出的是，限于研究時間和經(jīng)費，本文未對患者的術(shù)后生存期進行隨訪，也未將lncRNA UCA1與其它生物學標志物進行橫向?qū)Ρ?，這是本研究的不足之處，將在后續(xù)的研究中予以補充。

綜上所述，骨腫瘤患者可出現(xiàn)血漿lncRNA UCA1相對表達量的上調(diào)，特別是骨肉瘤患者的血漿lncRNA UCA1過表達更加明顯，血漿lncRNA UCA1相對表達量與骨肉瘤的疾病進展和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為骨肉瘤診斷及病情評價的輔助指標。