王粵淇 霍少川 陳德龍 張濛 唐宏宇 王海彬*
1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科學(xué)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510405 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科,廣東 廣州 510405
骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨吸收增多、骨顯微結(jié)構(gòu)損壞,最終導(dǎo)致易于骨折為特征的骨科疾病[1]。我國(guó)約有13%的人口患有骨質(zhì)疏松癥,且發(fā)病人數(shù)呈上升趨勢(shì),推測(cè)2020年患者人數(shù)可達(dá)2.86億[2]。表觀遺傳是不通過(guò)DNA改變就能導(dǎo)致可遺傳的基因表達(dá)變化,這種變化的調(diào)控方式包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和微小RNA(miRNA)等[3]。骨質(zhì)疏松與表觀遺傳關(guān)系密切[4],DNA低甲基化狀態(tài)能提高成骨分化效率[5],組蛋白去甲基化酶KDM4B能通過(guò)調(diào)節(jié)DLX基因族促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[6],miR-138通過(guò)抑制局部黏附激酶的表達(dá)阻礙成骨過(guò)程序[7]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥可能與體內(nèi) H3K9、H3K36甲基化升高有關(guān),組蛋白去甲基化酶JMJD2 A、JMJD2B是骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶點(diǎn)之一[8]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松的發(fā)生與腎虛存在密切關(guān)系[9],研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎健骨中成藥仙靈骨葆對(duì)骨質(zhì)疏松具有較好的臨床療效[10],目前缺少仙靈骨葆在表觀遺傳方面的研究,本研究觀察仙靈骨葆在去勢(shì)大鼠體內(nèi)防治骨質(zhì)疏松的潛在表觀遺傳學(xué)機(jī)制。
本次實(shí)驗(yàn)大鼠由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,通過(guò)動(dòng)物倫理批準(zhǔn)。12周齡的SPF級(jí)別雌性大鼠24只[許可證編號(hào):SYXK(粵)2013-0001;質(zhì)量合格證編號(hào):44005800008146],體重(302±19) g,飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF實(shí)驗(yàn)室,SD雌性大鼠適應(yīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物實(shí)驗(yàn)中心條件(溫度:24 ℃~26 ℃,濕度:67%,無(wú)菌狀態(tài),每天12 h光明/黑暗),大鼠自由獲取水和飼料。
藥物:仙靈骨葆膠囊由淫羊藿(加俄西)、地黃、丹參、川續(xù)斷(窩魁乃)等多種中藥制成,生產(chǎn)于貴州同濟(jì)堂制藥有限公司,藥品批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025337。福美加,生產(chǎn)于杭州默沙東制藥有限公司,藥品批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字J20130085。
1.2.1儀器:本實(shí)驗(yàn)所需儀器主要包括由Bio-Rad公司提供的熒光定量PCR儀器、電泳儀、逆轉(zhuǎn)錄儀、全能型凝膠成像系統(tǒng);Thermo公司提供的多功能酶標(biāo)儀;Eppendorf公司提供的離心機(jī);Leica公司提供的多功能自動(dòng)染色機(jī)、全自動(dòng)組織脫水,Merinton公司提供的微量核酸定量?jī)x,OLYPUS公司提供的研究型正置熒光生物顯微鏡,灰度分析軟件。
1.2.2試劑:本實(shí)驗(yàn)所需試劑主要包括由Genecopies公司提供的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(AOPR-1200),DBI公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DBI-2220);弗德生物提供的BCA蛋白定量試劑盒(FD2001);美國(guó)Sigma公司提供的伊紅液、蘇木精。引物設(shè)計(jì)為:JMJD2A:上游:5’-CTCTCCCTGGAGGAGAATAAGA-3’,下游:5’-GGTGTCAGCTGTTCAGAAGT-3’;H3:上游:5’-TCACTCAGGATGAATGGAAAGAG-3’,下游5’-CACCCATCCCTTCTGCATATA-3’;GAPDH(內(nèi)參):上游:5’-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3’,下游:5’-TACTCAGCACCAGCATCACC-3’,上述引物由廣州四和生物科技有限公司提供。
采用隨機(jī)數(shù)字表法將24只SD雌性大鼠分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組(6只/組)。陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠切除雙側(cè)卵巢,空白組大鼠僅去除卵巢周?chē)攘恐窘M織,術(shù)中及術(shù)后無(wú)大鼠死亡。1周后實(shí)驗(yàn)組予仙靈骨葆膠囊,陽(yáng)性對(duì)照組予福美加,參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[11],按大鼠-人等效給藥劑量換算,仙靈骨葆等效給藥劑量為30.85 mg/(100 g·d),福美加等效給藥劑量為11.7 mg/(100 g·d),空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組予等體積生理鹽水,給藥頻率:1次/d,6 d/周。大鼠每7天稱(chēng)1次體重并記錄,根據(jù)最新大鼠體重計(jì)算各組給藥劑量,持續(xù)喂藥3個(gè)月。
檢測(cè)指標(biāo):RT-PCR檢測(cè)組蛋白H3和JMJD2A mRNA;Western blot檢測(cè)H3K36me3、H3K9me3和JMJD2A蛋白表達(dá);HE染色觀察骨組織。
將50 mg左側(cè)股骨髁骨組織研成粉末狀后置入EP管內(nèi),加入1 mL Trizol Reagent進(jìn)行冰浴,并持續(xù)勻漿30 min,取勻漿后上清液至新EP管內(nèi),12 000 r/min離心15 min,上清液置入新EP管備用,提取總RNA。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)組蛋白H3和JMJD2A mRNA表達(dá)。
向裝有50 mg左側(cè)股骨髁骨組織的EP管內(nèi)加入約10倍股骨組織體積RIPA裂解液,勻漿處理,獲取總蛋白并進(jìn)行定量,上樣、電泳與轉(zhuǎn)膜,孵育一抗、二抗、成像、分析灰度值,校準(zhǔn)采用β-actin為內(nèi)參蛋白,采用蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來(lái)表示H3K36me3、H3K9me3和JMJD2A蛋白表達(dá)水平。
取右側(cè)股骨髁骨組織,沖洗,4%多聚甲醛液固定24 h以上,10%(w/v)EDTA脫鈣液中脫鈣約1個(gè)月,去酸、脫水、透明、浸潤(rùn),石蠟包埋后切5 μm厚片。蘇木精和伊紅(HE)染色,顯微鏡下觀察(bx53,奧林巴斯公司,日本),進(jìn)行描述性分析。
收集數(shù)據(jù)并用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。采用方差齊性檢驗(yàn),方差齊時(shí)采用單因素方差分析,方差不齊時(shí)采用非參數(shù)方差分析,多組間兩兩比較采取單因素方差分析LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
40×鏡下觀察,與空白組相比較,陰性對(duì)照組骨小梁分布較紊亂,連續(xù)性較差,數(shù)目明顯減少,厚度降低。與陰性對(duì)照組相比較,實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組骨小梁連續(xù)性較好、排列較為整齊,骨小梁數(shù)量稍增多,骨小梁厚度增加。400×鏡下觀察,陰性對(duì)照組骨髓腔脂肪細(xì)胞明顯多于實(shí)驗(yàn)組、空白組及陽(yáng)性對(duì)照組。見(jiàn)圖1。
圖1 各組大鼠股骨髁骨組織HE染色 A:空白組;B:陰性對(duì)照組;C:實(shí)驗(yàn)組;D:陽(yáng)性對(duì)照組。Fig.1 HE staining in the femoral and condyle bones of rats in each group. A: Blank group; B: Negative control group; C: Experimental group; D: Positive control group.注:各組中顯微鏡(400×)圖像置于(40×)圖像右側(cè)。圖中箭頭標(biāo)示脂肪細(xì)胞。
與空白對(duì)照組相比,陰性對(duì)照組JMJD2A mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05),組蛋白H3mRNA表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)。與陰性對(duì)照組相比較,實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照J(rèn)MJD2A mRNA表達(dá)水平上升(P<0.05),組蛋白H3mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間JMJD2A、組蛋白H3mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。
圖2 各組大鼠JMJD2A、組蛋白H3 mRNA表達(dá)水平Fig.2 mRNA expression levels of JMJD2A and histone H3 in each group注:與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05;與空白對(duì)照組比較,#P<0.05。
與空白對(duì)照組比較,陰性對(duì)照組JMJD2A蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),H3K9me3、H3K36me3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與陰性對(duì)照組比較,實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組JMJD2A蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),H3K9me3、H3K36me3蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組之間H3K36me3 蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3。
圖3 各組大鼠JMJD2A、H3K9me3、H3K36me3蛋白的表達(dá)水平Fig.3 Expression level of JMJD2A, H3K9me3, H3K36me3 proteins in each group注:與陰性對(duì)照組比較,*P<0.05;與空白對(duì)照組比較,#P<0.05。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為,骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制是骨重建時(shí)成骨-破骨之間的動(dòng)態(tài)平衡被改變[12]。骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)學(xué)范圍內(nèi)屬“骨痿”,病因病機(jī)以腎虛為本,脾虛為促進(jìn)因素[9]。仙靈骨葆膠囊主要由淫羊藿(加俄西)、地黃、丹參、川續(xù)斷(窩魁乃)等中藥組成,具有補(bǔ)腎益肝、強(qiáng)筋壯骨功效,是骨質(zhì)疏松癥首選中成藥制劑[13]。研究表明,仙靈骨葆可通過(guò)調(diào)節(jié)BMP-2、TIMP-1和PDGF的表達(dá)與PGI2和PGE2合成來(lái)提高骨質(zhì)疏松性骨折后骨密度[14],可顯著降低骨周轉(zhuǎn)率、促進(jìn)成骨及抑制脂肪生成、促進(jìn)骨小梁結(jié)構(gòu)改善[15],對(duì)骨吸收起抑制作用[16]。
組蛋白甲基化是將甲基轉(zhuǎn)移到賴(lài)氨酸殘基,賴(lài)氨酸存在不被修飾(me0)、一甲基化(me1)、二甲基化(me2)或三甲基化(me3)4種狀態(tài),這些組蛋白甲基化狀態(tài)導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子獲得相關(guān)基因啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控基因[17]。甲基化的調(diào)控受到組蛋白去甲基化酶和組蛋白賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(KMTs)的雙向調(diào)節(jié)[18]。據(jù)報(bào)道,KMT1E/ESET能提升H3K9me3的表達(dá)水平[19],并通過(guò)減少Runx2的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)抑制成骨分化[20]。組蛋白去甲基化酶被分為兩類(lèi):賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶家族和JmjC家族。KDMs從組蛋白賴(lài)氨酸殘基中去除甲基[21],JmjC家族組蛋白去甲基化酶通過(guò)2OGFe(II)依賴(lài)的雙氧酶反應(yīng)催化去除甲基殘基,發(fā)揮生物學(xué)功能[22]。JMJD2A又叫作KDM4A,是一種組蛋白去甲基化酶,它可以催化H3K9me3和H3K36me3去甲基化,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活和抑制因子的作用[23-24]。組蛋白去甲基化酶KDM4B/KDM6B能調(diào)節(jié)骨形成相關(guān)基因Runx 2、AP-1、ATF 4、Smad等的表達(dá),促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cell,BMSCs)成骨性分化[25],KDM4B和KDM6B通過(guò)消除 H3K9me3和H3K27me3甲基化修飾影響骨髓BMSCs向成骨細(xì)胞分化[6]。上述研究說(shuō)明JMJD2A能直接或間接通過(guò)組蛋白H3的第36和第9位點(diǎn)甲基化修飾影響成骨分化。
本研究結(jié)果表明,對(duì)比空白組,陰性對(duì)照組大鼠摘除卵巢后,HE股骨髁骨組織出現(xiàn)骨質(zhì)疏松病理特征,實(shí)驗(yàn)造模成功。陰性對(duì)照組中H3K9me3及H3K36me3表達(dá)增加,這與筆者前期研究結(jié)果存在一致性[8]。仙靈骨葆膠囊干預(yù)后,對(duì)比陰性對(duì)照組結(jié)果,去勢(shì)大鼠股骨髁骨組織中骨小梁結(jié)構(gòu)改善,髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞減少,JMJD2A高表達(dá)及H3K9me3和H3K36me3低表達(dá)。說(shuō)明仙靈骨葆膠囊對(duì)大鼠去卵巢后形成的骨質(zhì)疏松癥狀具有改善作用,能提高去勢(shì)大鼠骨組織中組蛋白去甲基化酶JMJD2A表達(dá)量,抑制H3K9me3、H3K36me3水平。
綜上所述,仙靈骨葆膠囊能參與去勢(shì)大鼠組蛋白修飾,其治療骨質(zhì)疏松癥的潛在機(jī)制可能通過(guò)提高JMJD2A表達(dá),抑制H3K9me3、H3K36me3表達(dá)實(shí)現(xiàn),為解釋仙靈骨葆膠囊在抗骨質(zhì)疏松治療中的表觀遺傳機(jī)制提供了一定的前期基礎(chǔ),但JMJD2A調(diào)控成骨-破骨平衡的機(jī)制暫不明確,仍需更深層次研究。