巨噬細胞在非酒精性脂肪性肝病中的作用

羅雨欣， 郭金波， 張曉嵐

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 消化內(nèi)科， 石家莊 050000

據(jù)統(tǒng)計，全球非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)平均發(fā)病率高達25.2%，其中以中東和南美地區(qū)最高，分別為31.8%、30.4%[1-2]；我國脂肪性肝病的平均患病率約為16.5%[3]，甚至有研究調(diào)查顯示上海地區(qū)成人NAFLD患病率高達43.65%[2]。因此，如何降低NAFLD的患病率及延緩或抑制其發(fā)病進程逐漸成為研究熱點。

NAFLD的發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認為“二次打擊”甚至“多重打擊”學(xué)說、腸道菌群紊亂、自噬、遺傳等被認為是其主要發(fā)病機制。其中作為NAFLD經(jīng)典發(fā)病機制的“二次打擊”學(xué)說認為，在第二次打擊中氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化等反應(yīng)可激活肝臟組織內(nèi)的固有免疫細胞，而巨噬細胞作為固有免疫重要的細胞群體之一，具有吞噬、抗原遞呈和免疫調(diào)節(jié)等功能，在NAFLD的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用。既往研究主要單純集中在NAFLD中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)對巨噬細胞表型變化的影響，近年來對巨噬細胞的研究更加深入完善，包括脂肪組織巨噬細胞(adipose tissue macrophages，ATM)在NAFLD發(fā)生中可促進血液單核巨噬細胞向肝臟募集[4]；Nod樣受體蛋白3 (Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體激活后可促進NAFLD中巨噬細胞活化從而加速肝臟炎癥反應(yīng)[5]；NAFLD發(fā)生時不僅出現(xiàn)腸道菌群紊亂并且其產(chǎn)生的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)可介導(dǎo)巨噬細胞CD14上調(diào)[6]，此外腸道菌群的代謝產(chǎn)物——棕櫚酸也可募集巨噬細胞至肝臟[7]，從而加劇肝臟炎癥反應(yīng)等等。本文就巨噬細胞在NAFLD中的新近研究進展進行綜述。

1 肝臟巨噬細胞的來源及其分類

肝臟中的巨噬細胞主要包括來源于胚胎早期卵黃囊時期祖細胞并在肝臟定居的巨噬細胞即枯否細胞，和來源于骨髓造血干細胞經(jīng)血液循環(huán)募集至肝臟的單核巨噬細胞2大類。當肝細胞受損時，激活的枯否細胞可募集血液中單核細胞至肝臟，并向CD11b+F4/80+巨噬細胞即經(jīng)典激活的M1型巨噬細胞分化，其可分泌TNFα、IL-1β、IL-6等促炎因子以及活性氧簇，加速肝臟組織損傷。同時這些巨噬細胞又可以分泌大量趨化因子，如C-C趨化因子配體(C-C chemokine ligand 2, CCL) 2、CCL3及CCL5等，募集血液循環(huán)中的單核巨噬細胞及T淋巴細胞進入肝臟，發(fā)揮其固有免疫及啟動適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)作用。另一方面，肝臟巨噬細胞的另一經(jīng)典分型即替代激活的M2型巨噬細胞，在抑制炎癥反應(yīng)及組織修復(fù)過程發(fā)揮重要作用。當巨噬細胞受到IL-4、IL-13等細胞因子刺激后可向M2型極化，在分泌大量TGFβ、IL-10、IL-4及IL-13等抑制炎癥因子的同時又可促進精氨酸酶活化從而使發(fā)揮促炎作用的M1型巨噬細胞凋亡，加速組織損傷修復(fù)和重塑。

2 巨噬細胞在NAFLD肝臟炎癥中的作用

目前在人類試驗和動物模型中均證實巨噬細胞參與了NAFLD進程中肝臟炎癥反應(yīng)。有研究[8]發(fā)現(xiàn)在人類肝臟單純脂肪變階段就存在門靜脈區(qū)巨噬細胞的浸潤，并且隨著肝臟脂肪變和炎癥程度的加重，肝臟中巨噬細胞數(shù)量也隨之增加[9]，提示巨噬細胞可能參與了NAFLD的進程。在動物實驗方面，有學(xué)者[10]證實了在NAFLD發(fā)病初期枯否細胞即可通過分泌TNFα等炎癥因子啟動肝臟炎癥反應(yīng)，并促進單核巨噬細胞向肝臟募集加重肝臟炎癥反應(yīng)；進一步應(yīng)用三氯化釓清除巨噬細胞后，NAFLD大鼠的胰島素抵抗明顯改善，且肝臟脂肪變和炎細胞浸潤減少[11]，證實在NAFLD中巨噬細胞起到了促進肝細胞脂肪變性和加速炎癥反應(yīng)的作用。

進一步分析NAFLD進程中巨噬細胞的表型變化，有學(xué)者[12]發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中肝臟表達髓過氧化物酶的巨噬細胞數(shù)量較單純脂肪變患者顯著升高，同時肝臟中炎癥因子IL-6、IL-8 mRNA的表達也明顯增多；在動物實驗中，應(yīng)用蛋氨酸-膽堿缺乏飲食飼養(yǎng)小鼠4周后小鼠肝臟出現(xiàn)NASH改變，應(yīng)用流式方法檢測到肝臟巨噬細胞數(shù)量增加，并且無論是血清還是肝臟中促炎因子IL-12、iNOS等表達均到達高峰，提示起著促炎效應(yīng)的M1型巨噬細胞在NAFLD發(fā)病前期發(fā)揮主要作用；隨著飼養(yǎng)時間的延長，第8周時小鼠肝臟發(fā)生明顯纖維化改變，同時巨噬細胞數(shù)量進一步增加且主要為M2型[13]，證實隨著NAFLD進展、肝臟纖維化的產(chǎn)生，M2型巨噬細胞在促進肝臟組織修復(fù)、參與結(jié)構(gòu)重建中起到主要作用。

3 巨噬細胞在NAFLD中的活化機制

3.1 ATM促進血液單核巨噬細胞向肝臟募集 脂肪組織不僅具有儲存脂肪的功能，同時還是一個免疫器官。其中，ATM在NAFLD發(fā)病中起到了一定的作用。有研究[14]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用高脂高膽固醇飲食飼養(yǎng)小鼠構(gòu)建NAFLD模型，在第6周時脂肪組織中巨噬細胞表面標志物F4/80及CCL2、CCL7等趨化因子的表達明顯高于肝臟組織，隨著飼養(yǎng)時間的延長，在16周及26周時肝臟組織中的巨噬細胞數(shù)量及TNFα、IL-1β等炎癥因子的表達才開始增多，這意味著當NAFLD發(fā)生時，脂肪組織內(nèi)巨噬細胞引起的炎癥可能先于肝臟組織。不僅如此，Bijnen等[4]分別將肥胖小鼠和瘦型小鼠的ATM回輸給喂養(yǎng)高脂飲食的小鼠，發(fā)現(xiàn)相比回輸瘦型小鼠ATM，回輸肥胖小鼠ATM的小鼠內(nèi)臟脂肪組織中的巨噬細胞趨化因子表達顯著增加，募集更多的中性粒細胞及巨噬細胞至肝臟，肝細胞損傷也更嚴重。同樣，在嚴重肥胖NASH患者的內(nèi)臟脂肪組織中也發(fā)現(xiàn)了主要表達在巨噬細胞和樹突狀細胞表面的促炎標志物CD11c的高表達，并且與肝臟組織活檢髓過氧化物酶和CD11c的表達呈正相關(guān)[4]；進一步提取NASH患者的內(nèi)臟脂肪組織的巨噬細胞進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其上清液中TNFα、IL-6等炎癥因子及CCL2較對照組明顯升高[15]，證實ATM可以介導(dǎo)巨噬細胞、中性粒細胞等向肝臟趨化，加重肝臟炎癥反應(yīng)。

3.2 NLRP3炎性小體活化可激活肝臟巨噬細胞 NLRP3炎性小體是一種細胞內(nèi)的模式識別受體，主要存在于巨噬細胞、樹突狀細胞及中性粒細胞，當其被激活時可分泌大量IL-1β、IL-18，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)。近年來有學(xué)者指出，NLRP3在NAFLD發(fā)病中也發(fā)揮著重要作用。Mridha等[5]分別應(yīng)用高脂和蛋氨酸-膽堿缺乏的飲食構(gòu)建2種NASH小鼠模型，均發(fā)現(xiàn)NASH小鼠NLRP3炎性小體及IL-1β的表達明顯升高，而應(yīng)用NLRP3特異性抑制劑MCC950后，NASH小鼠肝臟組織中包括F4/80陽性細胞在內(nèi)的炎性細胞浸潤明顯減少，IL-1β及CCL2的表達也顯著降低；另外，有研究[16]應(yīng)用髓系高表達NLRP3炎性小體的小鼠構(gòu)建NASH模型，發(fā)現(xiàn)肝臟炎癥以及IL-1β和TNFα等炎癥因子的表達及肝細胞焦亡數(shù)量較野生型NASH小鼠明顯增加；以上實驗均證實NLRP3炎性小體可以增加NASH小鼠炎癥因子及趨化因子的分泌，促進巨噬細胞向肝臟募集，加重肝臟炎癥反應(yīng)。進一步提取小鼠原代枯否細胞和骨髓來源的巨噬細胞并應(yīng)用LPS活化后發(fā)現(xiàn)，已被證實存在于NASH患者和小鼠肝組織中的膽固醇結(jié)晶體能夠激活巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎性小體，并且巨噬細胞培養(yǎng)液上清中IL-1β含量明顯升高；另有研究[17]報道，膽汁酸中的鵝去氧膽酸也能夠活化巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎性小體，增加IL-1β的分泌；然而對于敲除Toll樣受體4和髓樣分化因子88基因后的巨噬細胞培養(yǎng)液中IL-1β水平卻無明顯變化[6]，提示巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎性小體發(fā)揮作用可能需要二者的存在。

3.3 腸道菌群紊亂及其代謝產(chǎn)物影響肝臟巨噬細胞活化 2004年，B?ckhed等[18]發(fā)現(xiàn)無菌小鼠的體脂含量和肝臟甘油三酯水平明顯降低，提示腸道菌群可能參與了肝臟脂質(zhì)代謝，由此開啟了腸道菌群對NAFLD影響的研究。有學(xué)者[19]給予小鼠蛋氨酸-膽堿缺乏飲食構(gòu)建NASH模型，發(fā)現(xiàn)無論是飼養(yǎng)2周還是4周小鼠腸黏膜屏障均有不同程度的破壞，2周時另枝菌屬和真菌屬豐度明顯下降，瘤胃球菌科UCG-014豐度上升，4周時雙歧桿菌屬豐度下降，而擬桿菌屬豐度增加；同時糞便中的代謝組學(xué)特征也發(fā)生了明顯變化，2周時花生酸、十六烷、棕櫚酸及四十二烷改變最為明顯，而4周時膽酸、膽固醇、花生酸及二十四烷改變最為顯著，提示糞便中代謝產(chǎn)物的變化可以作為NAFLD進程的潛在生物標志物。

目前數(shù)據(jù)表明，腸道菌群來源的病原相關(guān)分子模式不僅可激活腸道內(nèi)的固有免疫系統(tǒng)，同時也激活了肝臟巨噬細胞，加重肝臟炎癥反應(yīng)，從而促進NASH的發(fā)展。有學(xué)者[7]發(fā)現(xiàn)NASH小鼠體內(nèi)注射低劑量的LPS后，可加重肝臟脂肪變性和纖維化，同時CD14陽性的巨噬細胞數(shù)量增加，而進一步將CD14沉默后，小鼠則表現(xiàn)為ALT和TNFα、IL-6表達下降，提示LPS可能通過介導(dǎo)巨噬細胞CD14上調(diào)，導(dǎo)致促炎因子釋放增加，同時這些促炎因子又可導(dǎo)致肝細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，從而加劇NASH。另外，腸道菌群作為一個“消化器官”，可產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，其中飽和脂肪酸便是其中一種。Yamada等[7]研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群產(chǎn)生的一種長鏈飽和脂肪酸-棕櫚酸可以促進CCL2分泌增加，導(dǎo)致肝臟內(nèi)巨噬細胞數(shù)量明顯增多，加重高脂肪飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪性肝炎，而清除腸道菌群后這種改變會被逆轉(zhuǎn)；提示腸道菌群的某些代謝產(chǎn)物可以通過巨噬細胞影響NAFLD的進程。

4 靶向巨噬細胞藥物在NAFLD中的應(yīng)用

總的來說，巨噬細胞在NAFLD中的作用比較明確，在發(fā)病初期主要是通過M1型巨噬細胞分泌一系列促炎因子以及趨化因子，加重肝臟的炎癥反應(yīng)，而隨著病程的發(fā)展轉(zhuǎn)為M2型巨噬細胞，在抑制炎癥、促進肝纖維化方面起主要作用。因而，針對巨噬細胞設(shè)計干預(yù)藥物治療NAFLD已成為研究熱點。根據(jù)巨噬細胞在NAFLD發(fā)病中的作用機制，目前有兩大類靶向藥物，包括直接靶向巨噬細胞藥物和間接靶向巨噬細胞藥物。

4.1 直接靶向巨噬細胞藥物 直接靶向巨噬細胞治療NAFLD藥物主要包括以下三類：(1)抗CD163藥物。有學(xué)者[20]發(fā)現(xiàn)巨噬細胞表面具有糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)，且具有肥胖基因的高脂飲食小鼠GR表達量明顯低于野生型小鼠，而經(jīng)高脂飲食飼養(yǎng)24周的巨噬細胞特異性缺乏GR小鼠較野生型小鼠肝臟組織CCL2、IL-6 mRNA水平明顯升高，提示糖皮質(zhì)激素可能成為治療NASH的新方案。為此，Svendsen 等[21]便應(yīng)用低劑量地塞米松治療高果糖誘導(dǎo)的大鼠NASH模型，發(fā)現(xiàn)其可明顯改善肝臟組織炎癥及纖維化，并且肝臟及血清中脂質(zhì)及TNFα、IL-1β水平也顯著降低，同時大鼠并未表現(xiàn)出嚴重的不良反應(yīng)，這就為日后低劑量糖皮質(zhì)激素有可能應(yīng)用于臨床治療NAFLD患者打下了基礎(chǔ)。(2)抗C-C趨化因子受體2 (C-C chemokine receptor 2, CCR2)/CCR5藥物。代表藥物Cenicriviroc是一種可口服的CCR2/CCR5雙重拮抗劑，可以抑制單核巨噬細胞向肝臟募集。有研究[22]發(fā)現(xiàn)，給予高脂飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠Cenicriviroc后，不僅能顯著降低血清ALT水平，并且纖維化明顯逆轉(zhuǎn)，但肝臟組織的炎癥及巨噬細胞的數(shù)量和極化分型無明顯變化；但在西方飲食和蛋氨酸-膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Cenicriviroc能夠減少巨噬細胞向肝臟募集，減輕肝臟炎癥及纖維化[23]。有Ⅱ期臨床試驗[24]共納入289例NASH患者，患者接受Cenicriviroc治療1年后，肝纖維化程度較安慰劑組明顯改善，但肝臟脂肪變及炎癥無明顯改變。(3)半乳凝素(galectin, Gal)-3阻斷劑。Gal-3是一種與糖蛋白末端半乳糖殘基結(jié)合的蛋白質(zhì)，主要表達于巨噬細胞，其早已被證實對肝纖維化具有促進作用，但對NASH的作用有爭議。有學(xué)者[25]認為Gal-3可促進高脂飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟脂質(zhì)聚積、炎細胞浸潤及肝纖維化；也有學(xué)者[26]發(fā)現(xiàn)在膽堿缺乏飼料誘導(dǎo)的NASH小鼠模型中Gal-3具有保護作用。最近一項研究[27]則指出，Gal-3可抑制NASH小鼠肝臟脂肪變，但能促進炎癥、肝細胞損傷和肝纖維化。GR-MD-02是一類Gal-3抑制劑，有研究[28]應(yīng)用其治療高脂飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠，發(fā)現(xiàn)不僅NAFLD活動積分明顯降低，甚至肝纖維化也顯著逆轉(zhuǎn)，同時肝臟巨噬細胞的Gal-3表達也明顯下降；不僅如此，目前已完成GR-MD-02治療經(jīng)肝組織活檢證實的NASH患者的Ⅰ期臨床試驗，受試者對GR-MD-02均有較好的耐受性，且無不良反應(yīng)，并且高劑量組具有一定的改善肝纖維化的效果[29]；目前已經(jīng)開展了臨床Ⅱ期試驗，結(jié)果可拭目以待。以上實驗/試驗均表明，這些藥物可能會成為很有前景的NAFLD治療方案(表1)。

4.2 間接靶向巨噬細胞藥物 間接靶向巨噬細胞藥物不直接針對巨噬細胞，但可作用于NAFLD發(fā)病過程中不同的通路，間接影響巨噬細胞的功能，主要包括以下幾類：(1)法尼醇X受體(farnesoid receptor, FXR)激動劑。代表藥物為奧貝膽酸，Yao 等[30]應(yīng)用高脂飲食誘導(dǎo)構(gòu)建NAFLD小鼠模型，并應(yīng)用LPS激發(fā)肝臟炎癥，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用FXR激動劑GW4064可減少肝臟中炎性細胞的浸潤以及巨噬細胞的數(shù)量，進一步在體外對小鼠巨噬細胞系RAW 264.7進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-1β和CCL2的表達也顯著下降；并且在NASH患者中發(fā)現(xiàn)隨著NAS評分的升高肝組織中的FXR表達也隨之下降。2015年的Ⅱb期臨床試驗[31]證實其對NAFLD患者除了能夠調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝，還具有抗炎抗纖維化作用；提示FXR激動劑可能部分作用于肝臟巨噬細胞來延緩NASH的發(fā)展。(2)胰高血糖素樣肽-1受體激動劑(glucagon-like peptide-1 receptor agonists, GLP1RA)。Exendin-4作為一種GLP1RA已被證實在NAFLD小鼠中會抑制CCL2的表達以及減少巨噬細胞在肝臟中的浸潤，并減弱巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白的攝取，減少膽固醇在巨噬細胞內(nèi)的沉積[32]。目前另一個代表藥物利拉魯肽已進入臨床試驗研究，證實其可以改善NAFLD患者肝組織脂肪變及纖維化程度[33]。(3)伊馬替尼。它為一種酪氨酸激酶抑制劑，有學(xué)者研究證實應(yīng)用伊馬替尼干預(yù)M1型腹膜巨噬細胞可以抑制TNFα、IL-6和IL-1β等促炎基因的表達，同時培養(yǎng)液上清中TNFα和IL-6水平明顯下降，相反，在M0型和M2型腹腔巨噬細胞中這些促炎基因表達無明顯變化；進一步構(gòu)建高脂飲食小鼠NASH模型，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用伊馬替尼3個月的小鼠肝組織中巨噬細胞數(shù)量明顯減少并且TNFα表達也顯著降低，提示伊馬替尼會減少巨噬細胞向肝臟募集并抑制巨噬細胞向M1型極化[34]。(4)過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR) γ激動劑——吡格列酮、PPARα/δ激動劑——Elafibranor、磷酸二酯酶(phosphodiesterase, PDE)抑制劑——Pentoxifylline、細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptotic signal-regulating kinase 1, ASK1)抑制劑——Selonsertib等藥物均在NAFLD中間接影響巨噬細胞發(fā)揮抗炎作用(表2)。

5 小結(jié)

目前為止，在NAFLD發(fā)病中關(guān)于巨噬細胞如何活化、募集至肝臟的作用機制已經(jīng)取得一定進展，包括巨噬細胞極化分型、ATM、巨噬細胞內(nèi)NLRP3炎性小體的激活、腸道菌群及其代謝產(chǎn)物對巨噬細胞的影響等方面，為NAFLD的治療提供了新思路，但目前針對直接巨噬細胞治療NAFLD的靶向藥物目前大多在基礎(chǔ)研究中顯示有效，而臨床還未有應(yīng)用或尚未完成Ⅳ期臨床試驗，需進一步深入研究。

表1 直接靶向巨噬細胞藥物分類及其作用

表2 間接靶向巨噬細胞藥物分類及其作用