不同階段慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中NF-κB/iNOS的表達(dá)及免疫狀態(tài)

黃 津， 張美泉， 何道興

1 福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院 感染科， 福建 南平 353000；2 福建省立醫(yī)院北院 感染科， 福州 350000

HBV仍是世界性的難題，平均每年死于HBV感染相關(guān)性疾病(如肝衰竭、肝硬化和肝癌)約100萬人[1]。目前，HBV感染的發(fā)病機(jī)制仍處于探索階段，主要與感染的年齡、途徑、病毒因素和機(jī)體免疫因素等有關(guān)，特別是針對HBV產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)成為研究熱點(diǎn)[2]。研究[3]表明，HBV感染者個(gè)體差異較大，在HBV感染過程中，淋巴細(xì)胞具有向感染的肝組織遷移、浸潤的特點(diǎn)，參與抗病毒免疫應(yīng)答及炎癥發(fā)生發(fā)展過程，并發(fā)揮著關(guān)鍵作用。核因子-κB(NF-κB)具有介導(dǎo)調(diào)控免疫炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄功能；誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)作為NF-κB下游重要的結(jié)合位點(diǎn)，在炎癥反應(yīng)時(shí)呈高度表達(dá)，其產(chǎn)生NO作為細(xì)胞免疫和細(xì)胞毒性的效應(yīng)分子，NF-κB-iNOS-NO信號通路在肝臟疾病的炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等反應(yīng)中起重要作用，在HBV患者不同階段外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的研究甚少，而將二者相關(guān)聯(lián)的研究尚無。因此，本課題旨在研究HBV患者不同發(fā)病階段外周血淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)水平，同時(shí)檢測PBMC中NF-κB、iNOS的蛋白表達(dá)水平并探討其對機(jī)體免疫的影響，深入研究宿主抵抗HBV感染的免疫反應(yīng)機(jī)制并挖掘潛在的免疫治療靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年10月-2019年1月福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院感染科收治的慢性乙型肝炎、肝衰竭、失代償期肝硬化、原發(fā)性肝癌患者各20例，其中男46例，女34例，年齡22～69歲，平均(49.6±13.3)歲，另選取10例健康志愿者作為對照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)慢性乙型肝炎患者診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[4]，同時(shí)HBsAg陽性>6個(gè)月，且HBV DNA持續(xù)陽性，ALT>200 U/L；(2)肝衰竭患者診斷符合《肝衰竭診治指南(2018年版)》[5]；(3)肝硬化患者診斷符合2018年歐洲肝病學(xué)會制訂的“失代償期肝硬化患者的管理臨床實(shí)踐指南”[6]，評分達(dá)Child-Pugh分級C級；(4)肝癌診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版) 》[7]，屬于Ⅱa期到Ⅲb期。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠、心血管疾病、代謝性疾病、嚴(yán)重感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、風(fēng)濕免疫性疾病。本研究獲得福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器和試劑 GIS凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)；CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE、CD19-APC、CD16/CD56-PE標(biāo)記抗體及IgG2bFITC/IgG1PE同型對照抗體(美國Becton Dickinson公司)；人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镉邢薰?；NO檢測試劑盒和人IL-6 ELISA試劑盒(南京建成公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；NF-κB p65抗體、iNOS抗體(武漢杰圣德生物科技有限公司)。

1.2.2 流式檢測淋巴細(xì)胞 留取各組外周靜脈血3 ml，使用EDTA抗凝，各取100 μl于流式專用試管中，分別加入50 μl熒光素標(biāo)記的單克隆抗體，室溫避光孵育20 min。各管均加紅細(xì)胞裂解液500 μl，室溫靜置15 min，加入500 μl稀釋液混勻，1500 r/min離心5 min，棄上清，再加稀釋液500 μl混勻，最后使用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，記錄CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD16+/CD56+結(jié)果。

1.2.3 Western Blot方法檢測NF-κB、iNOS蛋白的表達(dá) 各組研究對象均采集清晨空腹靜脈血(肝素抗凝)8 ml，3000 r/min離心10 min，分離血漿，-80 ℃冰箱保存。應(yīng)用密度梯度離心法分離PBMC，吸取白膜層放入離心管，加入PBS，室溫1500 r/min離心10 min，共2次。棄上清，加1 ml含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基，吹打混勻，制成PBMC細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后檢測。胰酶消化離心獲得細(xì)胞，加入冰預(yù)冷裂解緩沖液，高速冷凍離心機(jī)離心獲得蛋白，BCA法檢測蛋白濃度后，每管取20 μg蛋白量上樣，經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。在室溫下用50 g/L牛血清白蛋白封閉液進(jìn)行封閉2 h，洗膜后加NF-κB、iNOS、GAPDH一抗孵育(用5%的BSA抗體緩沖液按1∶1000稀釋抗體)，4 ℃封閉過夜；TBST洗滌3次，每次30 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，溫室封閉孵育2 h；用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)ECL顯影，通過曝光、顯影、定影，最后用Bandscan5.0圖像分析軟件分析各組蛋白目標(biāo)帶的分子量和灰度值，以NF-κB、iNOS與對應(yīng)的內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值相比，計(jì)算二者灰度比值。

1.2.4 硝酸還原酶法和ELISA法分別檢測血清中NO、IL-6水平 收集各組患者血清，嚴(yán)格依據(jù)檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 與對照組比較，肝炎組、肝衰竭組、肝癌組、肝硬化組總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均下降，且肝衰竭組、肝癌組及肝硬化組下降更明顯，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；肝衰竭組、肝癌組、肝硬化組總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與肝炎組比較亦明顯下降(P值均<0.05)(表1)。

表1 各組外周血總淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)水平比較

注：與對照組比較, 1)P<0.05；與肝炎組比較, 2)P<0.01。

2.2 各組外周血淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)水平比較 與對照組比較，肝衰竭組、肝癌組、肝硬化組CD3+下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，與肝炎組比較，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；肝衰竭組、肝癌組、肝硬化組與肝炎組比較CD4+下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；肝衰竭組較肝癌組、肝硬化組、對照組CD8+升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；肝衰竭組較其他4組CD4+/CD8+降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

肝衰竭組、肝硬化組、肝炎組和對照組比較，CD3-CD19+升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；肝衰竭組、肝癌組、肝炎組和對照組比較，CD16+CD56+下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表3)。

2.3 各組PBMC中NF-κB、iNOS蛋白表達(dá)水平的比較

各組間NF-κB蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.62，P<0.001)，其中肝硬化組、肝衰竭組、肝癌組NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯高于肝炎組，亦明顯高于對照組(P值均<0.05)；各組間iNOS蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=51.32，P<0.001)，其中肝硬化組、肝衰竭組、肝癌組iNOS蛋白表達(dá)水平明顯高于肝炎組，亦明顯高于對照組(P值均<0.05)(圖1)。

圖1 NF-κB、iNOS和GAPDH蛋白表達(dá)情況

2.4 各組NO和IL-6水平的比較 肝炎組、肝衰竭組、肝癌組、肝硬化組的NO水平與對照組比較明顯升高(P值均<0.05)；肝炎組、肝衰竭組、肝癌組、肝硬化組的IL-6的表達(dá)水平與對照組比較亦明顯升高(P值均<0.05)(表4)。

表2 外周血T淋巴細(xì)胞亞群百分率比較

注：與對照組比較, 1)P<0.05；與肝炎組比較, 2)P<0.05；與肝衰竭組比較, 3)P<0.05。

表3 自然殺傷細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞亞群百分率比較

注：與對照組比較, 1)P<0.05；與肝炎組比較，2)P<0.05。

表4 各組NO和IL-6水平比較

注：與對照組比較, 1)P<0.05。

3 討論

HBV感染者可以通過機(jī)體較強(qiáng)的免疫反應(yīng)將病毒完全清除，但仍有很大部分演變成慢性病毒感染[8]。慢性HBV感染后的結(jié)局包括無癥狀攜帶者、肝炎，甚至肝硬化和肝癌。研究[9]表明，HBV感染者個(gè)體差異很大，在不同階段的免疫功能、病毒復(fù)制水平及肝臟炎癥程度皆不盡相同，淋巴單核細(xì)胞在機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染后機(jī)體免疫細(xì)胞數(shù)量和比例下降，尤其以肝硬化組、肝衰竭組和肝癌組患者淋巴細(xì)胞比例下降更為明顯，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，這也提示了HBV感染者免疫狀態(tài)與乙型肝炎相關(guān)疾病的病程和病情嚴(yán)重程度有關(guān)。

HBV特異性免疫應(yīng)答在HBV清除中起主要作用，慢性感染時(shí)，HBV特異性T淋巴細(xì)胞易凋亡，寡克隆存在，分泌細(xì)胞因子功能和增殖能力顯著降低，T淋巴細(xì)胞功能耗竭，HBV持續(xù)復(fù)制[10]。CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞在抗原的識別、遞呈及各種細(xì)胞因子的分泌方面都起著極其重要的作用，在抗HBV感染免疫中起核心作用[11]。在HBV感染過程中CD3+、CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的激活可能導(dǎo)致機(jī)體對HBV產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致不同的臨床表現(xiàn)和轉(zhuǎn)歸[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在慢性乙型肝炎患者的不同感染階段，T淋巴細(xì)胞表達(dá)存在差異，肝衰竭組、肝癌組、肝硬化組與肝炎組比較，CD3+差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肝衰竭組、肝癌組、肝硬化組與肝炎組比較，CD4+明顯下降；肝衰竭組較肝癌組、肝硬化組、對照組CD8+明顯升高；肝衰竭組CD4+/CD8+較其他4組明顯降低。上述結(jié)果均提示HBV感染在發(fā)病階段細(xì)胞免疫功能明顯紊亂，CD4+T淋巴細(xì)胞消耗，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)，尤其是肝衰竭階段表現(xiàn)最為明顯，導(dǎo)致病毒不能有效的清除，加重肝細(xì)胞壞死。因此，在HBV感染過程中了解各亞群所發(fā)揮的作用是很關(guān)鍵的。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，肝衰竭組、肝硬化組CD3-CD19+與肝炎組、對照組比較明顯升高，肝衰竭組、肝癌組CD16+CD56+與肝炎組、對照組比較明顯下降，表明HBV感染早期階段機(jī)體免疫力尚能代償，隨著疾病進(jìn)展，機(jī)體體液免疫下降，有腫瘤惡性病變、肝衰竭發(fā)生傾向，表明體液免疫在乙型肝炎相關(guān)疾病中發(fā)揮一定的作用，這與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。

NF-κB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其生物學(xué)功能是調(diào)控基因，特別是免疫炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[14]。NF-κB除了對T淋巴細(xì)胞的活化、增殖有重要作用外，還可調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞免疫球蛋白基因的表達(dá)[15]。iNOS催化NO生成速度慢、量較多、持續(xù)時(shí)間長，主要造成細(xì)胞和組織損傷。馬雪蓮等[16]使用刀豆蛋白A刺激小鼠建立免疫性肝損傷模型，隨著刀豆蛋白A誘導(dǎo)時(shí)間延長，NF-κB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核的水平不斷增高，小鼠肝組織內(nèi)的iNOS增加，從而生成超過生理劑量并具有細(xì)胞毒性的NO，加重肝組織免疫損傷；而使用NF-κB抑制劑后，iNOS的表達(dá)下降，減少了NO的生成，肝損傷較前改善，由此認(rèn)為NF-κB調(diào)控iNOS可能是發(fā)生免疫性肝損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化組、肝衰竭組、肝癌組NF-κB和iNOS蛋白表達(dá)水平與肝炎組、對照組比較明顯增高，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。它們產(chǎn)生NO、IL-6等炎癥因子水平明顯超過正常健康人水平，由此推想NF-κB-iNOS-NO信號通路可能在肝臟疾病的炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等反應(yīng)中起重要作用。

總之，HBV感染相關(guān)疾病是以肝臟炎性病變?yōu)橹?，引起多器官損害的傳染性疾病。但其確切的發(fā)生機(jī)制尚不明確，目前國內(nèi)外研究均認(rèn)為HBV感染后激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫機(jī)制是導(dǎo)致肝組織損傷的主要原因。依據(jù)上述研究，NF-κB/iNOS/NO信號通路很可能參與HBV相關(guān)疾病的免疫反應(yīng)及影響。下一步將使用NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽干預(yù)各組研究對象后再檢測NF-κB/iNOS/NO的表達(dá)，明確對下游炎癥因子及免疫細(xì)胞的調(diào)控作用，深入探討乙型肝炎及其相關(guān)疾病發(fā)生的分子機(jī)制，以期對HBV感染性疾病的進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸在臨床免疫干預(yù)方面提供新的思路。