慶元甜橘柚黃龍病菌的Real-time PCR檢測與分析

吳遠(yuǎn)海，王夢萍，徐選美，姚月華，陳白，吳振伙，尹瑞安，吳利榮，鹿連明

(1.慶元縣自然資源和規(guī)劃局，浙江 慶元 323800； 2.慶元縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 慶元 323800；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 浙江省柑橘研究所，浙江 臺(tái)州 318020)

柑橘黃龍病(huanglongbing，HLB)是柑橘生產(chǎn)上的一種毀滅性病害，廣泛分布在亞洲、非洲、美洲等40多個(gè)國家和地區(qū)[1]。其病原物為韌皮部桿菌屬革蘭氏陰性細(xì)菌(CandidatusLiberibacter)，分為亞洲種(Ca. L. asiaticus)、非洲種(Ca. L. africanus)和美洲種(Ca. L. americanus)[2]，我國的黃龍病病原菌主要為亞洲種[3]。柑橘黃龍病菌可侵染包括柑橘屬、枳屬、金柑屬和九里香等多種蕓香科植物。柑橘新樹感病后在1～2年內(nèi)即死亡，老樹感病后3～5年內(nèi)死亡或喪失結(jié)果能力，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可造成毀園。柑橘黃龍病的猖獗危害和蔓延擴(kuò)散，對柑橘產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定和發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅，已經(jīng)成為柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大障礙。目前對該病害尚缺乏有效的防治藥劑和理想的抗病品種，主要采取以預(yù)防為主的綜合防治的方法來控制其發(fā)生和蔓延。因此，及時(shí)了解柑橘植株內(nèi)黃龍病菌的存在情況，對于該病害的有效防控具有重要的意義。

甜橘柚是慶元縣的特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，其種植面積達(dá)1 000 hm-2，年產(chǎn)量達(dá)2.1萬t。在2006年，孟幼青等[4]通過巢式PCR方法在甜橘柚中檢測到了柑橘黃龍病菌。近年來，麗水、溫州等地不斷有甜橘柚黃龍病嚴(yán)重發(fā)生甚至造成毀園的情況出現(xiàn)，而對于慶元縣甜橘柚黃龍病的發(fā)生情況鮮有研究報(bào)道。為此，本研究通過Real-time PCR方法對慶元縣甜橘柚樣品中的黃龍病菌進(jìn)行檢測，以期系統(tǒng)了解慶元縣甜橘柚黃龍病的發(fā)生分布情況，為當(dāng)?shù)馗涕冱S龍病的綜合防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

2019年6月份在慶元縣松源街道、屏都街道、竹口鎮(zhèn)、黃田鎮(zhèn)、淤上鄉(xiāng)等甜橘柚種植基地，通過癥狀識(shí)別的方法對柑橘黃龍病進(jìn)行初步調(diào)查。每個(gè)基地選取3～5株表現(xiàn)疑似柑橘黃龍病癥狀的甜橘柚植株，每株采集3～5片植株中下部黃化葉片為一個(gè)樣品，共采集74個(gè)樣品。將所采集樣品置于塑料自封袋中寄送至浙江省柑橘研究所進(jìn)行檢測。

1.2 試劑和引物

植物DNA提取試劑盒購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；Real-time PCR試劑Premix ExTaq購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。

Real-time PCR引物為HLBas：5′-TCGAGCGCG TATGCAATACG-3′和HLBr：5′-GCGTTATCCCGTAG AAAAAGGTAG-3′，探針為HLBP：5′-AGACGGG TGAGTAACGCG-3′(5′ FAM標(biāo)記，3′ BHQ-1標(biāo)記)，由TaKaRa公司合成。

1.3 總DNA提取

每個(gè)樣品稱取0.1 g葉片組織，于無菌研缽中用液氮研磨成粉末后，用植物DNA提取試劑盒提取甜橘柚葉片總DNA，具體操作按說明書進(jìn)行。

1.4 Real-time PCR檢測

Real-time PCR檢測反應(yīng)體系為20 μL，包含2×Premix ExTaq10 μL，250 nmol·L-1的上下游引物各1 μL，150 nmol·L-1探針1 μL，待測樣品DNA 1 μL，無菌雙蒸水6 μL；反應(yīng)在Bio-Rad CFX96 PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)Real-time PCR所檢測樣品的Ct值，分析樣品是否感染有柑橘黃龍病菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜橘柚黃龍病的癥狀

感染黃龍病菌的甜橘柚的葉片典型癥狀為斑駁黃化(圖1)，果實(shí)典型癥狀表現(xiàn)為“紅鼻子果”，即果實(shí)頂部不轉(zhuǎn)色，而果蒂部轉(zhuǎn)黃，在田間可根據(jù)此癥狀對甜橘柚黃龍病進(jìn)行診斷。而葉片均勻黃化等癥狀易與缺素癥狀等混淆，不宜作為甜橘柚黃龍病的田間診斷依據(jù)。

2.2 黃龍病菌的檢測

根據(jù)Real-time PCR所檢測樣品的Ct值對檢測結(jié)果進(jìn)行判定：若樣品Ct值≤35，判定該樣品為柑橘黃龍病陽性；若Ct值>35或無數(shù)值，則判定該樣品為柑橘黃龍病陰性。在所采集的74個(gè)樣品中，除有5個(gè)樣品因葉片腐爛無法檢測外，其他69個(gè)樣品的檢測結(jié)果見表1。從中可知，在所檢測的慶元縣5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)共69份樣品中，有13份樣品檢出攜帶黃龍病菌，陽性率達(dá)18.8%。其中松源街道和屏都街道樣品的陽性率最高，可達(dá)33.3%；而黃田鎮(zhèn)的10個(gè)樣品，未檢出黃龍病菌。

2.3 黃龍病發(fā)生的分析

慶元縣位于浙江省西南部，毗鄰福建省，所轄3個(gè)街道、6個(gè)鎮(zhèn)、10個(gè)鄉(xiāng)。其中甜橘柚主要種植在松源街道、屏都街道、竹口鎮(zhèn)等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，從本次抽

表1 慶元甜橘柚黃龍病菌Real-time PCR檢測結(jié)果

樣檢測結(jié)果可知，柑橘黃龍病已在慶元各甜橘柚主產(chǎn)區(qū)普遍存在(圖2)。分析認(rèn)為，其普遍發(fā)生的原因主要有以下兩點(diǎn)：一是柑橘苗木的無序調(diào)運(yùn)導(dǎo)致柑橘黃龍病的傳播擴(kuò)散；二是由于黃龍病菌傳播媒介昆蟲柑橘木虱的遷飛造成柑橘黃龍病的發(fā)生蔓延。浙江省麗水市、溫州市和福建省均為柑橘黃龍病的疫區(qū)，這些區(qū)域間帶菌柑橘苗木的調(diào)運(yùn)和柑橘木虱的遷飛或是慶元甜橘柚黃龍病發(fā)生的主要原因。

■—慶元甜橘柚的主產(chǎn)區(qū)；▲—本次診斷有黃龍病發(fā)生的地區(qū)。圖2 慶元縣甜橘柚主產(chǎn)區(qū)和黃龍病發(fā)生區(qū)域

3 小結(jié)與討論

本研究通過Real-time PCR測定了采自慶元縣5個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)(街道)共69個(gè)甜橘柚葉片樣品中柑橘黃龍病菌的存在情況。從檢測結(jié)果可以看出，柑橘黃龍病已在慶元縣松源街道、屏都街道、竹口鎮(zhèn)等主要甜橘柚產(chǎn)區(qū)存在，因本次檢測樣品數(shù)量有限，未檢測到陽性的黃田鎮(zhèn)也不能完全排除存在黃龍病

的可能性。由于甜橘柚樹勢比較強(qiáng)健，在病菌侵染初期植株通常未表現(xiàn)出明顯的黃龍病病害癥狀，因此，很多種植戶對該病害的防控缺乏足夠的重視。但近幾年麗水、溫州等地區(qū)一些甜橘柚基地黃龍病嚴(yán)重發(fā)生甚至造成毀園的情況時(shí)有發(fā)生，且慶元縣所處地區(qū)及周邊地區(qū)均為柑橘黃龍病重病區(qū)，因此，當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)部門和種植戶務(wù)必應(yīng)加強(qiáng)對該病害的防控意識(shí)。一是要杜絕從疫區(qū)調(diào)運(yùn)未經(jīng)檢疫的柑橘苗木，二是要加強(qiáng)對柑橘木虱的阻截和防治。此外，積極開展對柑橘黃龍病菌的檢測和對病害的診斷，對已確診感染黃龍病菌的植株要徹底挖除銷毀。通過統(tǒng)防統(tǒng)治，有效控制柑橘黃龍病的發(fā)生蔓延，保障慶元甜橘柚產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。