孕期酒精暴露致DNA 甲基化異常對子代小鼠心臟發(fā)育相關基因表達的影響

羅孝美，韓笑，彭昌，鄧玲，黃麗欣

孕期飲酒可致胎兒酒精綜合征，心臟發(fā)育畸形便是該綜合征較為嚴重的畸形之一[1-2]。但遺憾的是，酒精暴露致心臟發(fā)育異常的機制仍不清楚。本課題組前期研究證實[3-4]，組蛋白乙?；揎検Ш鈪⑴c介導了孕期酒精暴露致胎鼠心臟發(fā)育異常；但組蛋白乙?；揎検Ш獠⒉荒芡耆忉尵凭┞吨滦呐K發(fā)育畸形。近年研究證實[5-6]，DNA 甲基化是表觀遺傳中的另一種重要修飾方式直接參與了心臟發(fā)育的調(diào)控。之前本課題組另一項研究也證實組蛋白甲基化和乙?；换フ{(diào)控在心臟發(fā)育過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用[7]。因此，推測在酒精暴露致心臟發(fā)育異常的過程中甲基化修飾失衡可能也發(fā)揮了重要調(diào)控作用。故本研究以DNA 甲基化修飾為切入點探討孕期酒精暴露對心臟發(fā)育相關基因表達水平的影響，希望對孕期飲酒致子代心臟發(fā)育異常的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取健康性成熟SPF 級昆明小鼠作為研究對象，昆明小鼠購置于重慶醫(yī)科大學，按雌 :雄=2 :1合籠，次晨發(fā)現(xiàn)陰栓雌鼠胎齡記為0.5 d。將孕鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為4 組：正常組、對照組、酒精組、干預組，每組6 只。在胎齡 0.5 d～16.5 d期間，酒精組每日給予56%酒精5 ml/kg 灌胃1 次，干預組在給予56%酒精的基礎上每日腹腔注射1次DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）特異性抑制劑5-氮雜胞苷（2.5 mg/kg），對照組予等量生理鹽水灌胃及等量二甲基亞砜（DMSO）腹腔注射，正常組未給予任何處理。

1.2 小鼠心臟標本制備

至孕期16.5 d，二氧化碳麻醉處死孕鼠，剖開腹腔找到串珠樣子宮取出胚胎并收集胎齡16.5 d 胎鼠心臟放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要儀器及試劑

熒光定量PCR儀（Bio-Rad，CFX96，美國），Agena MassArray DNA 質(zhì)譜分析系統(tǒng)（Agena Bioscience，美國），抗心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）單克隆抗體（Abcam，英國），抗心房利鈉肽（ANP）抗體（Santa Cruz，美國），β-actin 兔來源多克隆抗體（中杉金橋，北京），辣根過氧化物酶（hHRP）標記山羊抗兔的二抗（中杉金橋，北京），DNA 提取試劑盒（BioTeke，北京百泰克生物技術有限公司），熒光定量PCR 試劑盒（Takara，大連寶生物工程有限公司），DNA 提取及純化試劑盒（Solarbio，北京索萊寶科技有限公司），DNMT 測定試劑盒（GENMED，美國）。

1.4 實驗方法

1.4.1 心肌組織DNA 提取及純化

胎鼠心肌組織使用液氮研磨成粉末狀，再用酚抽提法即可得到基因組DNA。實驗步驟嚴格按照試劑盒操作說明進行。

1.4.2 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶活性測定

參照文獻報道[8]運用DNMT 測定試劑盒檢測胎鼠心肌組織中DNMT 活性，運用OD=450 nm 波長酶標儀檢測，嚴格按照試劑盒說明操作。DNMT 活性[OD/（h·mg）]=（樣品OD-空白OD）×1 000/[樣品蛋白量（μg）×孵育時間（h）]。

1.4.3 心臟核心轉(zhuǎn)錄因子心肌細胞增強因子2A 啟動子區(qū)DNA 甲基化測序

參照文獻報道甲基化測序方法[9]，整理待檢測CpGs 序列信息成標準格式，將目的序列輸入到EpiDesigner 軟件進行引物設計，合成引物。通過酶標儀及凝膠電泳檢測DNA 濃度及純度。NaHSO3處理待測DNA 樣本。對DNA 樣本進行PCR 擴增反應、蝦堿酶（SAP）消化反應、轉(zhuǎn)錄和酶切反應。樹脂純化后通過Agena MassArray 系統(tǒng)（Agena Bioscience，美國）檢測DNA 甲基化。根據(jù)含G 峰和含A 峰的面積比較，計算出待檢樣品甲基化及非甲基化程度，屬于兩者相對定量比值，檢測所得的原始數(shù)據(jù)，即代表該樣品中對應甲基化位點的甲基化程度。

1.4.4 染色質(zhì)免疫共沉淀

取胎鼠心臟組織30 mg，預冷磷酸緩沖液清洗后加入終濃度為1 %的甲醛交聯(lián)。超聲切割DNA至200 bp～1 000 bp 之間。加入染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）級抗心肌細胞增強因子（MEF2A）抗體4 ℃搖床過夜沉淀DNA 片段和蛋白質(zhì)復合物，65 ℃水浴逆轉(zhuǎn)交聯(lián)6 h～ 8 h，純化和回收DNA 片段。用核酸蛋白測定儀測定A260 nm/A280 nm 比值，以確定ChIP 后DNA 的濃度及純度，進行PCR 擴增。

1.4.5 蛋白免疫印跡法

提取胎鼠心肌組織核蛋白，8 % SDS-PAGE 凝膠分離核蛋白，PVDF 膜半干轉(zhuǎn)膜后，5 %脫脂牛奶封閉2 h 后分別加入兔來源抗ANP、cTnT、β-MHC單克隆抗體（1：1 000）及β-actin 兔來源多克隆抗體（1：1 000）4 ℃孵育過夜，TBST（100 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，20% Tween 20，pH7.4）洗滌3 次，每次15 min，然后加入h HRP 標記山羊抗兔的二抗（1：5 000）脫色搖床上孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次15 min，運用Bio-Rad 圖像分析儀進行圖像掃描；采用Quantity One 4.4 軟件進行分析。

1.4.6 實時熒光定量PCR 引物序列和退火溫度

針對MEF2A 基因CDS 核心編碼區(qū)設計特異性引物，引物用Primer Premier 5.0 軟件設計，由大連寶生物公司合成。將MEF2A 基因產(chǎn)物進行梯度稀釋，運用Bio-Rad CFX96 實時熒光定量PCR 儀擴增，做出標準曲線，得到R2值和擴增效率。引物序 列：MEF2A(F)5'-CAGGTGGTGGCAGTCTTGGA-3'，MEF2A(R) 5'-TGCTTATCCTTTGGGCATTCA-3'，產(chǎn)物大?。?60 bp。反應條件：預變性：95 ℃ 30 s，變性：95 ℃ 5 s，退火延伸：58 ℃ 30 s，39 個循環(huán)。選取β-actin 作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)用Bio-Rad CFX96 實時熒光定量PCR 儀自帶基于pfaffl 原理的相對定量數(shù)據(jù)分析軟件分析。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)應用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析，連續(xù)性變量用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

胎鼠心肌組織中DNMT 活性（表1）：比色法結果顯示，胎鼠心肌組織中DNMT 活性在酒精組和DNMT 抑制劑5-氮雜胞苷干預組較對照組和正常組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而對照組較正常組DNMT 活性未見明顯變化，兩組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 孕期酒精暴露對胎鼠心臟發(fā)育相關基因表達水平及DNMT 活性的影響a（）

表1 孕期酒精暴露對胎鼠心臟發(fā)育相關基因表達水平及DNMT 活性的影響a（）

注：a：除比較胎鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動子區(qū)DNA 甲基化水平為各組3 只胎鼠外，余者均為6 只。DNMT：DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶；MEF2A：心肌細胞增強因子2A；mRNA：信使RNA；ANP：心房利鈉肽；cTnT：心肌肌鈣蛋白；β-MHC：β-肌球蛋白重鏈。與對照組和正常組相比*P＜0.05

心臟發(fā)育核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動子CpG 島DNA 甲基化水平（表1、圖1）：心臟發(fā)育核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動子區(qū)CpG 島測序結果表明，酒精組和干預組小鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動子+75 bp 和+325 bp DNA 甲基化水平較對照組和正常組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05）。

圖1 胎鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動子區(qū)DNA 甲基化檢測凝膠圖和圓點圖（n=3）

心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A mRNA 水平（表1）：實時熒光定量PCR 結果顯示：酒精組和干預組小鼠心肌組織中心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A mRNA 水平較對照組和正常組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05）。

心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 對心臟發(fā)育結構基因的調(diào)控作用（圖2）：ChIP 結果表明，小鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 能夠結合到心臟發(fā)育相關結構基因ANP、cTnT 及β-MHC 啟動子區(qū)域，因而可能直接參與上述基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

心臟結構基因ANP、cTnT 和β-MHC 的表達水平（表1、圖3）：蛋白免疫印跡法結果顯示，與對照組和正常組相比，酒精組和干預組的心臟結構基因ANP、cTnT 及β-MHC 的蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05）。

圖2 染色質(zhì)免疫共沉淀分析胎鼠心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A對心臟結構基因啟動子的結合作用（n=3）

圖3 Western blot 分析各組胎鼠心臟發(fā)育結構基因ANP、cTnT 和β-MHC 的蛋白水平（n=6）

3 討論

孕期飲酒可以導致胎兒心臟發(fā)育畸形，但具體機制不清楚。小鼠心臟發(fā)育過程與人類非常相似，故本研究通過酒精暴露孕期小鼠來探討酒精對小鼠心臟發(fā)育的影響。實驗結果發(fā)現(xiàn)酒精暴露的子代小鼠心臟組織中DNMT 活性較對照組顯著減低，DNA 甲基化測序結果也發(fā)現(xiàn)心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動子區(qū)甲基化水平在酒精組和干預組均顯著降低，為了進一步證實甲基化變化在酒精暴露小鼠心臟中的作用，給予DNMT 抑制劑5-氮雜胞苷干預，結果也證實在子代小鼠心肌組織中DNMT活性和心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動子區(qū)甲基化水平在干預組顯著降低，其變化趨勢與酒精暴露組的變化趨勢相一致。此外，實時熒光定量PCR 結果也進一步證實心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 的轉(zhuǎn)錄水平在酒精暴露組及干預組顯著升高。這些結果均提示酒精介導的DNA 低甲基化可能參與了心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。心臟發(fā)育結構基因的正確表達是構建完美心臟的基礎，心臟發(fā)育結構基因包含較多，如ANP、β-MHC、cTnT、cTnI、α-MHC、Cx43 等。本課題組前期研究[3-4,10]發(fā)現(xiàn)，ANP、β-MHC、cTnT 這幾個基因在酒精暴露及心肌肥厚的小鼠心肌組織中其表達水平出現(xiàn)明顯異常，提示這些基因與病理性心臟疾病中可能發(fā)揮重要作用。在本研究中檢測的ANP、β-MHC、cTnT的表達水平在酒精組和干預組均顯著升高，其變化趨勢與心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 啟動子DNA 甲基化水平相對應。轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的關鍵因子，參與眾多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。ChIP 結果證實，心臟核心轉(zhuǎn)錄因子MEF2A 能夠結合到心臟結構基因ANP、β-MHC、cTnT 啟動子區(qū)參與這些基因的調(diào)控。因此，上述結果表明DNMT 介導的DNA 甲基化修飾失衡可能是孕期酒精暴露致子代小鼠心臟發(fā)育相關基因表達異常的重要調(diào)控因素。心臟發(fā)育是十分復雜而精細的過程，任何微小的變化均會導致心臟發(fā)育異常[11-14]。國外研究證實[6,15-16]，甲基化修飾參與了哺乳動物的心臟發(fā)育過程，且經(jīng)酒精干預的小鼠心臟組織中發(fā)現(xiàn)甲基化修飾異常。因此，本研究結果與國外研究相一致。但本研究僅檢測了一部分心臟發(fā)育相關基因，其他心臟發(fā)育相關基因的表達情況如何以及是哪些DNMT 亞型在其中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用仍有待進一步研究證實。