Q開關(guān)NYAG 1 064 nm激光對表皮葡萄球菌活性及結(jié)構(gòu)的影響

談桂其， 鐘靜， 翁智勝, 彭潔雯， 李曉輝， 廖夢怡， 易江華， 辛甜甜

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科， 廣東 廣州 510150)

1 對象與方法

1.1 標(biāo)本來源及培養(yǎng)基

表皮葡萄球菌病原體來源于我院皮膚科門診毛囊炎患者，臨床表現(xiàn)典型，結(jié)合病原學(xué)檢查，診斷符合《皮膚性病學(xué)》細(xì)菌性毛囊炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。

培養(yǎng)基: 胰蛋白胨大豆肉湯瓊脂平板(TSA)，Leeming-Notman培養(yǎng)基。

1.2 主要儀器

Q開關(guān)摻釹釔鋁石榴石激光治療儀(長春佳技光電科技有限公司，型號JJ-10A)，透射電子顯微鏡(HITACHI，型號：HT7700)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株鑒定 選取毛囊炎患者膿皰，75%酒精消毒表面，用無菌針頭挑破膿皰，用力擠出膿液并挑取至TSA、Leeming-Notman培養(yǎng)基，用無菌接種環(huán)劃線接種，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。僅見TSA培養(yǎng)基上菌落長出，取單一菌落進(jìn)行基因測序鑒定。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及操作 選擇二次傳代菌體，挑取單一菌落于玻片上，予10 μL無菌生理鹽水稀釋，均勻涂平，待自然干燥，分為實(shí)驗(yàn)組與對照組。實(shí)驗(yàn)組：激光光斑直徑2 mm，脈寬≤8 ns，以500、600、700、800、900 mJ(即能量密度為15.9、19.1、22.2、25.4、28.7 J/cm2)照射菌體，分別為A、B、C、D、E組；對照組不予激光照射。實(shí)驗(yàn)組與對照組共6組，各組均10個(gè)標(biāo)本。

1.3.3 菌體活性測定 集落形成試驗(yàn)[5]：激光照射后將每組菌體用無菌生理鹽水洗脫并收集于EP管中，搖勻制成菌懸液，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算每組菌懸液濃度，調(diào)整至相同濃度后劃線接種于TSA，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)7天，每日觀察、計(jì)算菌落數(shù)，比較各組間菌落數(shù)。

1.3.4 透射電鏡觀察 將每組菌體用無菌生理鹽水洗脫并收集于EP管中，離心去上清液，加入固定液，再經(jīng)后固定、脫水、滲透、包埋、切片、染色，最后透射電鏡下觀察，采集圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。各組菌落數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間菌落數(shù)比較采用單因素方差分析;對照組與各實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)組激光能量與菌落數(shù)的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

經(jīng)16SrRNA 基因擴(kuò)增，測序結(jié)果與BLAST 比對顯示表皮葡萄球菌株(GenBank No.NR_113957.1)100%。

2.2 菌體活性

集落形成試驗(yàn)：培養(yǎng)7天后各組培養(yǎng)基上均可見菌落，對照組菌落數(shù)最多，實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)明顯減少。各組菌落數(shù)詳見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)比較，6組菌落數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 536.97，P<0.05)；對照組與實(shí)驗(yàn)A、B、C、D、E組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為7.28、35.20、48.74、57.37、63.58，P值均<0.05)。激光能量與菌落數(shù)呈高度負(fù)相關(guān)(r=-0.90，P<0.05)。

2.3 透射電鏡觀察

實(shí)驗(yàn)組和對照組均可見細(xì)胞壁表面分布大量絮狀物(多糖、脂類及蛋白)，細(xì)胞膜皺縮、破裂，質(zhì)壁分離，原生質(zhì)濃縮，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊。對照組細(xì)胞壁完整，厚度不均勻，平均厚度64 nm。實(shí)驗(yàn)組中：A組細(xì)胞壁局部明顯增生，平均厚度183 nm；B組細(xì)胞壁局部明顯增生，平均厚度115 nm，細(xì)胞膜大面積消失；C組細(xì)胞壁平均厚度70 nm，細(xì)胞膜小面積溶解，胞內(nèi)可見高電子密度顆粒聚集，細(xì)胞基質(zhì)溶解；D組細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)模糊，平均厚度69 nm，細(xì)胞膜小面積溶解，胞內(nèi)可見高電子密度顆粒聚集，細(xì)胞基質(zhì)溶解；E組細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)模糊，平均厚度92 nm，細(xì)胞膜大面積溶解，胞內(nèi)可見高電子密度顆粒聚集，細(xì)胞基質(zhì)溶解。詳見圖1、圖2A～2E。

表1 不同能量激光照射后各組菌落數(shù)對比

圖1對照組:細(xì)胞壁完整；細(xì)胞膜皺縮；細(xì)胞基質(zhì)無異常 圖2實(shí)驗(yàn)組2A：細(xì)胞壁粗糙；細(xì)胞膜皺縮；細(xì)胞基質(zhì)無異常；2B:細(xì)胞壁粗糙；大面積細(xì)胞膜消失；細(xì)胞基質(zhì)無異常;2C：細(xì)胞壁粗糙,結(jié)構(gòu)模糊；小面積細(xì)胞膜溶解；細(xì)胞基質(zhì)溶解;2D:細(xì)胞壁粗糙,結(jié)構(gòu)模糊；小面積細(xì)胞膜溶解；細(xì)胞基質(zhì)溶解;2E:細(xì)胞壁粗糙,結(jié)構(gòu)模糊；大面積細(xì)胞膜溶解；細(xì)胞基質(zhì)溶解

Fig.1Control group: the cell wall was complete.The cell membrane was wrinkled.The cell matrix was normal.Fig.2Treatment group.2A:The cell wall was rough.The cell membrane was wrinkled.The cell matrix was normal;2B: The cell wall was rough.A large area of cell membrane disappeared.The cell matrix was normal;2C: The cell wall was rough with fuzzy structure.A small area of cell membrane was dissolved.The cell matrix was dissolved;2D: The cell wall was rough with fuzzy structure.A small area of cell membrane was dissolved.The cell matrix was dissolved;2E: The cell wall was rough with fuzzy structure.A large area of cell membrane was dissolved.The cell matrix was dissolved.

3 討論

表皮葡萄球菌是臨床上最常見的凝固酶陰性的葡萄球菌，是一種條件致病菌，一般粘附于人體的皮膚和粘膜，是毛囊炎致病菌之一[1]。本研究的表皮葡萄球菌來源于臨床符合毛囊炎表現(xiàn)患者，馬拉色菌培養(yǎng)基陰性,并經(jīng)基因測序證實(shí)。表皮葡萄球菌性毛囊炎臨床上主要外用或口服抗生素治療，但隨著臨床抗生素的廣泛使用、甚至濫用，其耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，給治療帶來困難[6-7]。