窄譜中波紫外線聯(lián)合吡美莫司乳膏對(duì)成人型特應(yīng)性皮炎患者PBMC產(chǎn)生eotaxin和CCR3表達(dá)的影響

楊艷， 李嘉彥， 周欣， 田歆， 高愛莉， 熊斯穎， 李薇， 陳曉吟， 劉玉梅, 朱慧蘭

(廣州市皮膚病防治所，廣東 廣州 510095)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種慢性免疫異常性皮膚病,也是臨床上常見的過敏性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制與趨化因子存在密切關(guān)系，趨化因子與靶細(xì)胞上相應(yīng)受體特異性結(jié)合是各種免疫細(xì)胞完成炎癥反應(yīng)中的組織定位、浸潤(rùn)、再循環(huán)和歸巢等效應(yīng)的分子基礎(chǔ)。窄譜中波紫外線(narrowband-UVB,NB-UVB)具有生物活性較強(qiáng)、不良反應(yīng)較少、患者依從性好等特點(diǎn),已在臨床上得到了較為廣泛的應(yīng)用，但其作用于特應(yīng)性皮炎的機(jī)理還不清楚。吡美莫司乳膏為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑,具有免疫抑制作用。本研究檢測(cè)NB-UVB聯(lián)合吡美莫司乳膏治療特應(yīng)性皮炎前后，患者外周血嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)趨化因子eotaxin及其受體 CCR3的變化，以了解其治療機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

30例成人型中重度AD患者來自于2019年5-12月本所皮膚科門診，其中男16例,女14例;年齡18～53歲，平均(27.97±9.37)歲;病程1～32年，平均(19.83±8.03)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合特應(yīng)性皮炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1];②無嚴(yán)重心、肝、腎及其他臟器疾?。虎壑委熐?個(gè)月內(nèi)未接受過任何光療;④治療前3個(gè)月內(nèi)全身或局部未使用過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑。排除妊娠、哺乳及光敏感等特殊情況。本研究中患者均已簽署知情同意書，研究通過倫理審批(批件號(hào)：201715)。

1.2 儀器與試劑

儀器：UV 100 L型紫外線照射儀(德國(guó)沃曼公司), 波長(zhǎng)310～315 nm, 峰值為311 nm；BD FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD公司)。試劑：鼠抗人CCR3-FITC 及同型對(duì)照(美國(guó)R&D公司)；人 eotaxin 定量 EIA 試劑盒(上海森雄科技實(shí)業(yè)公司)。

1.3 標(biāo)本采集和處理

清晨空腹抽取所有研究對(duì)象肘靜脈血10 mL，經(jīng)肝素200 U抗凝，采用Ficoll 密度梯度離心法分離PBMC及細(xì)胞收集與培養(yǎng)。

1.4 治療方法

采用 NB-UVB照射,每周3次，連續(xù)照射3個(gè)月。NB-UVB照射方法: 以照射儀附帶的最小紅斑量(minimal erythema dose,MED)測(cè)試附件測(cè)定患者皮膚(前臂)MED為參考劑量。 再根據(jù)此參考劑量減20%作為初始照射劑量, 平均為0.6 J/cm2, 治療后再根據(jù)患者皮膚反應(yīng)程度調(diào)整照射劑量。一般在前次照射后無紅斑反應(yīng)的前提下,每次增加照射劑量20%, 最大照射劑量為3.4 J/cm2。治療時(shí)患者需配戴UV防護(hù)眼鏡,接受全身照射者須穿短褲以保護(hù)生殖器部位。

治療期間患者早晚一次全身均勻涂抹一薄層維生素E乳膏保濕，在醫(yī)生明確診斷為AD部位上外用吡美莫司乳膏(1%濃度，每日2次，治療3個(gè)月)。

1.5 療效評(píng)價(jià)

采用歐洲SCORAD評(píng)分系統(tǒng)[2],對(duì)AD皮損及臨床嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估。采用視覺模擬尺度(visual analogue scale，VAS)評(píng)分法對(duì)瘙癢程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。于治療前和治療結(jié)束后記錄SCORAD分值及VAS分值, 評(píng)價(jià)療效。評(píng)分由同一位醫(yī)師專門負(fù)責(zé)。

1.6 ELISA檢測(cè)AD患者血清中eotaxin水平

采用雙抗體夾心法， 操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 熒光抗體標(biāo)記及流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMC中CCR3水平

在指標(biāo)管中加入 10 μL CCR4-FITC 試劑， 然后在檢測(cè)管中分別加入 100 μL 抗凝血，并設(shè)立同型對(duì)照管， 振蕩混勻，室溫避光孵育20 min；加入2 mL的溶血素，振蕩混勻，室溫避光5 min，然后1 000 r/min離心5 min，棄上清液;加入PBS 2 mL，再1 000 r/min離心5 min，棄上清液;加入PBS 300 μL混勻。應(yīng)用BD FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀上機(jī)檢測(cè)。應(yīng)用CellQuest軟件，分別以FSC/SSC給細(xì)胞設(shè)門，獲取門內(nèi)10 000個(gè)細(xì)胞/每管，分析CCR3表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 治療前后患者SCORAD、VAS分值變化

治療過程中無脫落病例。治療后患者的SCORAD及VAS分值均較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)。詳見表1。

表1 AD患者治療前后SCORAD、VAS分值比較Tab.1 Comparison of SCORAD and VAS prior to and after treatment among the

2.2 AD患者eotaxin水平及PBMC中CCR3表達(dá)水平比較

患者血清e(cuò)otaxin水平治療后明顯下降，與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.20，P<0.01)。治療后患者PBMC產(chǎn)生的CCR3表達(dá)水平亦明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.59,P<0.01)。詳見表2。

表2 AD患者治療前后PBMC產(chǎn)生eotaxin水平及CCR3表達(dá)的比較Tab.2 Comparison of the expression levels of eotaxin and CCR3 prior to and after treatment among the

3 討論

目前大量研究證實(shí),嗜酸性粒細(xì)胞是特應(yīng)性皮炎發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，遲發(fā)相變態(tài)反應(yīng)的持續(xù)因子。嗜酸性粒細(xì)胞在局部皮損中的浸潤(rùn)與CC型趨化因子有密切的關(guān)系。趨化性細(xì)胞因子與靶細(xì)胞上相應(yīng)趨化因子受體特異性結(jié)合是各種免疫細(xì)胞完成炎癥反應(yīng)中的組織定位、浸潤(rùn)、再循環(huán)和歸巢等效應(yīng)的分子基礎(chǔ)[3]。

eotaxin是 CC 型化學(xué)趨化因子家族的成員，一種嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)選擇性的β-趨化劑，正在成為治療過敏性疾病的重要標(biāo)靶。eotaxin 趨化嗜酸性粒細(xì)胞到反應(yīng)部位并促使它們分泌大量的毒性成分: 嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白、 嗜酸性粒細(xì)胞衍生的神經(jīng)、嗜酸性粒細(xì)胞堿性蛋白和嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶，這些物質(zhì)可引起皮膚的組織損傷和瘙癢，從而表現(xiàn)為特應(yīng)性皮炎的一系列臨床癥狀。 體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)均證實(shí)， 在抗原刺激下， 組胺可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞表面eotaxin的表達(dá)，并且可以提高嗜酸性粒細(xì)胞的黏附能力以及從微血管中遷移至組織的能力[4]。體外實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，嗜酸性粒細(xì)胞可遷移和通過重組的人型血管內(nèi)皮黏附分子-1 預(yù)先涂鋪過的濾紙，而eotaxin能明顯增強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞的這種遷移能力[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)eotaxin可以引起局部嗜酸性粒細(xì)胞的增多，而且呈時(shí)間和劑量的依賴性，同時(shí)伴隨肥大細(xì)胞脫顆粒的加強(qiáng)和組胺釋放的增加[6-7]。選擇性的CCR3拮抗劑的應(yīng)用可明顯抑制eotaxin 所致的嗜酸性粒細(xì)胞的趨化募集，而更為重要的一點(diǎn)是，遲發(fā)相變態(tài)反應(yīng)中的嗜酸性粒細(xì)胞的募集也同樣得到了抑制[8-9]。而國(guó)內(nèi)胡南等[10]已經(jīng)證實(shí)eotaxin在AD患者外周血表達(dá)增強(qiáng)。

NB-UVB 照射通過抑制嗜酸性粒細(xì)胞在細(xì)胞趨化與活化抑制細(xì)胞因子合成而起到治療特應(yīng)性皮炎作用,治療成人及兒童AD 患者具有療效好、安全、光毒反應(yīng)輕且不增加光照后皮膚癌發(fā)生率等優(yōu)點(diǎn),是中、重度AD 的一線光療法[11]。Dayal等[12]在一項(xiàng)NB-UVB治療的長(zhǎng)期安全性的研究中，對(duì)30例4～14歲的兒童AD患者采用NB-UVB治療，每周2次，很多患兒在第6次照射時(shí)SCORAD和VAS分值明顯下降，第24次治療后分值下降更為明顯，在停止照射后的第2年上述分值仍維持較低水平，未見反復(fù)及不良反應(yīng)，取得了良好的療效。

外用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑 (topical calcineurin inhibitors，TCIS)包括他克莫司和吡美莫司，其唯一被批準(zhǔn)使用的適應(yīng)癥是AD。吡美莫司(pimecrolimus)是由鏈霉菌Streptomyceshygroscopicusvarascomycetes產(chǎn)生的子囊霉素巨內(nèi)酰胺的衍生物，其外用制劑為 1%乳膏。吡美莫司選擇性地抑制前炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，與FKBP-12有高親和性，在基因轉(zhuǎn)錄水平阻斷淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子合成，下調(diào) Th1(IL-2、INF-γ)以及Th2 (IL-4/IL-5/IL-10)的合成；研究證實(shí)吡美莫司可選擇性作用于皮膚的肥大細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞，但不影響成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞系，不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且經(jīng)皮膚吸收少，具有較強(qiáng)抗炎活性，但不具有糖皮質(zhì)激素的副作用[13-16]。大量短期臨床研究均已證實(shí)吡美莫司外用治療成人和兒童AD安全有效[17]，大規(guī)模長(zhǎng)期臨床觀察以及藥代動(dòng)力學(xué)研究也進(jìn)一步證實(shí)了 TCIs 的臨床有效性和安全性[18]。

大量文獻(xiàn)證實(shí)窄譜中波紫外線或吡美莫司乳膏治療AD的療效較佳，但具體作用機(jī)制不明，以往的文獻(xiàn)也已證實(shí)正常人外周血血清中eotaxin水平遠(yuǎn)低于AD組[19-21]。目前國(guó)內(nèi)外就窄譜中波紫外線聯(lián)合吡美莫司乳膏治療成人型AD的療效較少。本研究結(jié)果顯示，窄譜中波紫外線聯(lián)合吡美莫司乳膏治療成人型AD患者后,SCORAD和VAS評(píng)分明顯降低，且PBMC產(chǎn)生的eotaxin含量及受體CCR3明顯下降，提示聯(lián)合治療可能通過降低eotaxin和CCR3表達(dá)，從而減少嗜酸性粒細(xì)胞的募集和活化，并進(jìn)一步減少炎性介質(zhì)和毒性蛋白的釋放，達(dá)到減輕特應(yīng)性皮炎患者組織損傷和皮膚瘙癢的目的。

綜上所述，窄譜中波紫外線聯(lián)合吡美莫司乳膏治療成人型AD安全、有效，作用可能是通過降低eotaxin和CCR3的表達(dá)這一途徑來實(shí)現(xiàn)，但本研究樣本量較小，需在下一步行大樣本研究證實(shí)，以供臨床醫(yī)生參考。