低磷脅迫下內(nèi)生真菌對宿主杉木幼苗生理生化的影響

艾如波，徐彩瑤，吳承禎,4，李 鍵，林 晗，謝安強*

(1.福建農(nóng)林大學 林學院，福建 福州 350002； 2.福建省高校 森林生態(tài)系統(tǒng)經(jīng)營與過程重點實驗室，福建 福州 350002； 3.南京大學 地理與海洋科學學院，江蘇 南京 210023； 4.武夷學院，福建 南平 354300)

磷是植物生長發(fā)育所需的重要元素之一，是植物主要有機分子的關(guān)鍵部分(如蛋白質(zhì)、核酸、膜磷脂、ADP、ATP和NADP等)，在植物的新陳代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時也影響作物的品質(zhì)和產(chǎn)量[1-2]。相關(guān)研究表明，在大多數(shù)土壤中，由于Ca、Fe和Al化合物以及粘粒的大量存在，土壤磷的活性很低；又因活性磷在土壤中易被固定，植物對磷肥的利用率亦極低。因此，土壤中可供植物吸收利用的有效磷缺失，大量磷不能供植物體利用，造成植物“遺傳學缺磷”(指維持植物體自身生長和能夠進行親代遺傳所需要的磷元素含量缺失)，而不是“土壤學缺磷”(指植物正常生長，需要通過根部吸收來自土壤中的必需磷元素)。植物磷高效利用的研究主要有形態(tài)學、生理學以及遺傳學3種機制[5-8]。

植物內(nèi)生真菌是指生活于不同健康植物體的各種組織和器官中，同時與宿主植物體互利共生達到減少宿主病害、減產(chǎn)等作用的微生物。可通過傳統(tǒng)的形態(tài)學和現(xiàn)代分子生物學進行鑒定和確定其內(nèi)生性。內(nèi)生真菌主要是由子囊菌及其無性型組成，也包括少數(shù)擔子菌和接合菌[10]。CARROLL[11]定義內(nèi)生菌為生活在地上部分，在植物體內(nèi)未能引起明顯病害癥狀的真菌。內(nèi)生菌包括內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)和內(nèi)生細菌(Endophytic bacteria)。內(nèi)生真菌多樣性研究表明，植物內(nèi)生菌幾乎存在于所有目前已研究過的植物中，分布廣，種類多，目前已對松屬[12-14]、榿木屬[12]、桉屬[15-16]、冬青櫟屬[17]、山毛櫸屬[18]、紅豆杉屬[19]等進行廣泛的研究。內(nèi)生真菌的研究主要集中在兩方面，一是來自于植物體作為宿主本身的影響，二是對植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的研究[20]。研究表明，感染有益內(nèi)生菌的植物宿主往往具有生長迅速、抗脅迫、抗干旱、抗高溫等優(yōu)勢。

杉木是中國南方最常見的經(jīng)濟造林樹種，以存活率高、造林率高、造材率高、成本低在森林經(jīng)營上受到普遍歡迎，其成林面積和儲蓄量居我國人工林首位[21]。但作為我國特有的速生商品材樹種，杉木在持續(xù)性經(jīng)營過程中出現(xiàn)了許多問題，如林分生長力下降、林地土壤肥力下降、病蟲害加劇、生物多樣性降低等[22]。獲得對杉木提高抗逆性及促進生長發(fā)育作用的內(nèi)生真菌菌株是實現(xiàn)杉木可持續(xù)經(jīng)營的一種新途徑。為此，筆者等以低磷脅迫下的杉木為研究對象，通過試驗分析不同內(nèi)生真菌下杉木植株的葉片電導率、丙二醛、超氧化物歧化酶和可溶性蛋白含量，分析在低磷脅迫下內(nèi)生真菌對杉木生理特征的影響，探明內(nèi)生真菌與杉木植物互作后提高其抗逆性和促進生長的效果，為生產(chǎn)應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于福建農(nóng)林大學福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)過程與經(jīng)營重點田間實驗室。東經(jīng)118°08′～120°31′，北緯25°15′～26°39′，屬典型的亞熱帶季風氣候，氣溫適宜，溫暖濕潤，夏長冬短，無霜期達326 d。年平均日照數(shù)為1 700～1 980 h；年平均降水量為900～2 100 mm；年平均氣溫為20～25℃，最冷月1—2月，平均氣溫6～10℃；最熱月7—8月，平均氣溫33.7℃。極端氣溫最高42.3℃，最低-2.5℃。年相對濕度約77%。

1.2 試驗材料

杉木幼苗：1年生杉木組培苗，由福建省林科院提供。

菌株：無柄盤菌屬Peziculasp.(NG1)，毛霉屬Mucorsp.(CG5)，擬青霉屬Paecilomycessp.(AJ6)，絲葚霉屬Papulosporasp.(AJ14)，青霉屬Penicilliumsp.(AJ13)，均篩選自成年老齡杉木，其中，菌株AJ6已獲國家發(fā)明專利(專利名稱：1株能促進杉木磷吸收的內(nèi)生真菌，保藏編號：No.9186)，保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設(shè)計 試驗采用土培盆栽試驗。選擇長勢一致的苗木定植于直徑15 cm、高10 cm的塑料盆中，每盆放入經(jīng)高壓滅菌的黃心土約3 kg。經(jīng)過2個月的恢復性生長后開始接種試驗。將制備的等濃度100 mL菌液(5個菌液)連續(xù)3 d分別從植物頂端施澆，確保其根、莖、葉及土壤中均有菌液，設(shè)置5個重復，以水溶液為空白對照。接種15 d后進行低磷脅迫處理。

1.3.2 菌液制備 使用馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(PDB)，在50 mL的液體培養(yǎng)基中接入供試菌株，然后經(jīng)過恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。按10倍稀釋法使用無菌生理鹽水稀釋菌液，通過在顯微鏡下觀察血球計數(shù)板計算并配制成濃度為5.5×106cfu/mL的菌液。

1.3.3 低磷脅迫設(shè)計 通過施氮肥、鉀肥及其他微量元素確保變量唯一，低磷脅迫采用KH2PO4。試驗設(shè)計4個磷處理水平，正常條件磷含量為48 mg/kg、輕度脅迫磷含量為24 mg/kg、中度脅迫磷含量為12 mg/kg、重度脅迫磷含量為0 mg/kg，各處理5個重復。盆栽基質(zhì)土壤為黃心土，經(jīng)測定其pH為4.50、有機質(zhì)21.82 mg/g、全氮0.32 mg/g、水解氮0.11 mg/g、全磷0.40 mg/g、有效磷0.004 1 mg/g、全鉀12.47 mg/g、速效鉀0.03 mg/g。

1.3.4 電導率測定 電導率測定參考陳愛葵等[23]的方法進行。經(jīng)自來水沖洗干凈的葉片用蒸餾水沖洗3次，并用濾紙吸干殘留的水分?？焖俜Q取鮮樣0.1 g放在具塞試管中，加入10 mL去離子水，浸提24 h后，搖勻，用電導儀測定浸泡液的電導率(A1)。然后放入100℃沸水浴中30 min，以殺死植物組織，取出后冷卻至室溫后搖勻，測得煮沸電導率(A2)。以相對電導率表示細胞膜透性的大小。

相對電導率=A1/A2×100%

1.3.5 植物生理指標測定 丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及可溶性蛋白含量均參照王學奎[24]的方法進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理與初步處理采用Excel 2003，作圖采用Origin8.0，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用Spss18.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷脅迫下不同菌種對杉木幼苗相對電導率的影響

植物膜系統(tǒng)狀況的良好反應以相對電導率來作為重要參照，植株受到干擾或侵害下主要發(fā)生質(zhì)膜破損，膜蛋白變性失活導致質(zhì)膜傷害、胞液外滲而使相對電導率增大，此現(xiàn)象比較直觀，是一個具實際性的數(shù)據(jù)[23]，同時能夠衡量植物細胞組織的幼嫩程度和確定細胞質(zhì)膜受傷害的程度[25]。從圖1可知，正常條件下，接種不同菌株幼苗的葉片相對電導率多數(shù)呈上升趨勢，其中，接種菌株NG1幼苗的相對電導率則先降后升；在該條件下，菌株NG1、AJ6和AJ14作用下幼苗的相對電導率比對照低。輕度脅迫條件下，各處理的相對電導率呈上升趨勢，其中，接種AJ14菌株的杉木幼苗葉片相對電導率較對照低。中度脅迫條件下，各處理葉片相對電導率多數(shù)呈上升趨勢，且在脅迫中期(30～45 d，下同)，除接種CG5菌株外，其余接種內(nèi)生真菌幼苗的相對電導率比對照低，當脅迫至60 d時均比對照高。重度脅迫條件下，各處理的葉片相對電導率均呈上下波動趨勢。其中，接種NG1和AJ13菌株的幼苗葉片相對電導率變化趨勢相近，且變化幅度較大，呈先升后降再略微回升的趨勢；而接種CG5菌株幼苗葉片相對電導率和對照的變化趨勢類似，在數(shù)值上也相近；接種AJ6和AJ14菌株的幼苗葉片相對電導率均比對照低，且接種AJ14菌株的幼苗葉片相對電導率在整個脅迫期間都低于對照。從整體上看，不同脅迫梯度條件以及不同脅迫動態(tài)下，各處理幼苗葉片相對電導率的值均為0.2%～0.5%。

總體看，正常條件下，菌株NG1、AJ6和AJ14能夠有效緩解低磷脅迫的危害；輕度脅迫條件下，菌株AJ14能較好地保護植株生長；中度脅迫條件下，各菌株在脅迫前中期(15～45 d，下同)均能顯著緩解低磷脅迫；重度脅迫條件下，菌株AJ6和AJ14表現(xiàn)良好，能有效緩解逆境對植株的傷害。

2.2 低磷脅迫下不同菌種對杉木幼苗超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是一種源于植株體的活性物質(zhì)，在活性氧的清除、控制膜脂過氧化水平及減輕膜的傷害上起重要作用[26]，外部環(huán)境條件能影響超氧化物歧化酶的活性水平，植物在逆境下受到的傷害以及植物對逆境抵抗能力往往與體內(nèi)的超氧化物歧化酶的活性水平有關(guān)[27]。由圖2可知，正常條件下，接種不同內(nèi)生真菌的杉木幼苗葉片SOD活性的變化趨勢不一致；其中，對照的幼苗葉片SOD活性穩(wěn)定在335～345 U/g，接種CG5菌株的幼苗葉片SOD活性在整個脅迫期間均比對照高，而接種AJ14菌株的幼苗葉片SOD活性除脅迫初期(15 d)比對照低之外其余脅迫時期均比對照高。輕度脅迫條件下，對照的幼苗葉片SOD活性呈先上升后下降的變化趨勢；接種內(nèi)生真菌的幼苗葉片SOD活性的變化趨勢總體而言比較穩(wěn)定，除接種菌株NG1幼苗的SOD活性在初期較低外，其余處理的葉片SOD活性都比對照高。中度脅迫條件下，各處理的SOD活性的動態(tài)變化曲線比較集中，接種AJ6和NG1的幼苗SOD活性出現(xiàn)較大波動，分別為先下降后略微上升和先小幅度下降后逐漸上升的變化趨勢；至脅迫60 d時，各處理幼苗葉片SOD活性很相近，且都比對照大，接種菌株NG1、AJ6、CG5、AJ14、AJ13幼苗的SOD活性分別比對照活性高23.48%、23.80%、24.25%、20.78%和19.32%。重度脅迫條件下，對照的幼苗葉片SOD活性的變化趨勢為先略微上升后下降，接種菌株處理的幼苗葉片SOD活性，除接種AJ6菌株幼苗的活性呈先降后升外，其余菌株均為先略微上升后下降再上升的變化趨勢；至脅迫60 d時，接種菌株NG1、AJ6、CG5、AJ14和AJ13幼苗的SOD活性分別比對照高28.44%、28.80%、28.51%、23.65%和30.09%。

綜上所述，與對照相比，菌株NG1、AJ6、CG5、AJ14及AJ13都可以顯著提高杉木幼苗葉片的SOD活性，對杉木幼苗均有一定的緩解低磷脅迫的作用，但不同菌株發(fā)揮作用的時間和強度不同。

2.3 低磷脅迫下不同菌種對杉木幼苗丙二醛的影響

丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，一個作為衡量氧化膜脂程度大小的重要指標。所以，通過研究植株體內(nèi)丙二醛含量的動態(tài)性變化能夠知曉其反映該樹種抗逆性能力的大小[28]。從圖3可知，正常條件和重度脅迫梯度條件下，隨著脅迫時間的延長，對照幼苗葉片的MDA含量呈先增后減趨勢，輕度脅迫和中度脅迫條件下，隨著脅迫時間的延長，對照幼苗葉片的MDA含量呈逐漸減少趨勢，接種內(nèi)生真菌處理杉木幼苗的MDA含量總體呈緩慢增加，到60 d時，接種內(nèi)生真菌杉木幼苗葉片的MDA含量顯著高于對照。綜上所述，不同低磷脅迫梯度下，接種不同內(nèi)生真菌幼苗的葉片MDA含量在脅迫15 d、30 d、45 d內(nèi)都比對照低，至脅迫60 d時都比對照高。從葉片MDA含量的角度分析，在脅迫中前期，接種不同內(nèi)生真菌植株的MDA含量的差異并不明顯，且變化幅度不大。

2.4 低磷脅迫下不同菌種對杉木幼苗可溶性蛋白的影響

可溶性蛋白是一種為植物體提供營養(yǎng)的物質(zhì)，其含量高低與植物抗逆性有直接的關(guān)系[29]。從圖4可知，對照在不同梯度脅迫下隨著脅迫時間的推移，杉木幼苗可溶性蛋白均呈先降后升趨勢。同時，各脅迫梯度的脅迫初期，對照幼苗可溶性蛋白含量均比其他處理高。隨著脅迫時間的延長，不同脅迫處理的各接種菌株處理幼苗的葉片可溶性蛋白含量呈先升后降趨勢。在不同脅迫梯度下，各接種菌株幼苗因接種菌株的可溶性蛋白含量動態(tài)變化不同。正常條件下，各處理幼苗在脅迫45 d，可溶性蛋白含量比對照高，在脅迫中后期(30～60 d，下同)接種菌株NG1和AJ13的幼苗葉片可溶性蛋白含量在整個中后期都比對照高。輕度脅迫條件下，接種菌株AJ6、AJ14和AJ13的幼苗葉片可溶性蛋白含量在整個脅迫中后期都比對照高。中度脅迫條件下，接種菌株AJ6、AJ14的幼苗在整個中后期表現(xiàn)較好。重度脅迫條件下，接種菌株NG1、AJ6、AJ14和AJ13的幼苗在整個脅迫中后期葉片可溶性蛋白含量都比對照高。

綜上可知，接種菌株不能在各脅迫梯度的整個脅迫動態(tài)期間都發(fā)揮促進植物生長的作用。不同菌株作用下幼苗的可溶性蛋白含量在不同脅迫梯度中的動態(tài)變化均大致呈先升后降趨勢。菌株AJ6和AJ14在低磷脅迫下能有效提高杉木幼苗的可溶性蛋白含量。

3 結(jié)論與討論

生理特性通過測定植物細胞滲透物質(zhì)和抗氧化物酶活性等指標來分析。膜透性的增大是膜系統(tǒng)被破壞的表現(xiàn)之一，膜透性的大小可用電解質(zhì)滲漏率即電導率的變化來衡量[30]。葉片相對電導率在正常條件下，菌株NG1、AJ6和AJ14能有效緩解低磷脅迫的危害。輕度脅迫條件下，菌株AJ14能較好地保護植株生長；中度脅迫條件下，各菌株在脅迫中前期均能顯著緩解磷脅迫；重度脅迫條件下，菌株AJ6和AJ14表現(xiàn)良好，能有效緩解逆境對植株的傷害。丙二醛(MDA)含量是衡量膜脂過氧化程度的一個非常重要的生理指標，在不同脅迫梯度下，5株溶磷菌均能在脅迫15～45 d顯著緩解低磷環(huán)境對植株的危害，脅迫至60 d時，MDA含量均比對照高。超氧化物歧化酶SOD是源于生物體的一種活性物質(zhì)，能夠催化超氧化物離子生成O2和H2O2，作為廣泛分布于各生命體內(nèi)的抗氧化物酶和主要清除生物體內(nèi)自由基的物質(zhì)，被稱為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線[30]。同時在外部能夠衡量并影響著超氧化物歧化酶的活性水平，植物受逆境傷害下可以知道植物對逆境抵抗能力往往與體內(nèi)的超氧化物歧化酶的活性水平有關(guān)[27]。與對照相比，菌株NG1、AJ6、CG5、AJ14和AJ13都可顯著提高SOD活性，對杉木幼苗均有一定的抵御低磷脅迫的作用，以菌株AJ14效果最佳?？扇苄缘鞍追e極參與細胞滲透壓的調(diào)節(jié)。在抗逆性環(huán)境下，迫使植物體內(nèi)的一些基因關(guān)閉，誘導一些能夠拮抗逆境的基因表達，導致正常蛋白合成受阻[31]，通過調(diào)節(jié)可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來提高植物的耐低磷性[32]。接種菌株不能在各脅迫梯度的整個脅迫動態(tài)期間都發(fā)揮促進植物生長的作用。不同菌株作用下幼苗的可溶性蛋白含量在不同脅迫梯度中的動態(tài)變化大致都呈先升后降的趨勢。通過分析比較，菌株AJ6和AJ14在低磷脅迫下能有效提高杉木幼苗的可溶性蛋白含量。

研究在菌液的配制上，僅探索了單一菌株對杉木幼苗的影響，在今后的研究中將開展混合菌對杉木生長發(fā)育的影響；在低磷脅迫梯度上，僅設(shè)置4個脅迫梯度，還存在一定的局限性，未能更好更全面地體現(xiàn)杉木對磷脅迫完整的響應機制。由于時間的限制，試驗僅研究了內(nèi)生真菌-杉木共生體的各種特性，對各種響應機制的深層次原因未涉及，對植株有顯著促進作用的菌株，后續(xù)可開展對其次生代謝物質(zhì)及分子水平等相關(guān)領(lǐng)域的研究。