提高斷血流提取物指標成分得率的工藝研究

劉文佳 黃光偉 黃 靜 梁雪松

(柳州兩面針股份有限公司，廣西，柳州，545001)

前言

斷血流來源于唇形科風(fēng)輪菜屬植物風(fēng)輪菜Clinopodium chinense (Benth) O. Kuntze 和蔭風(fēng)輪 Clinopodium pdycephalum (Vaniot) C. Y. Wuet Hsuan 植物的干燥地上部分，為 2015年版《中華人民共國藥典》收載的常用中藥, 具有涼血、止血之功效, 臨床上是一種止血良藥, 主要用于治療崩漏、尿血、鼻衄、牙齦出血、創(chuàng)傷出血、子宮肌瘤出血等出血癥[1]。斷血流所含成分比較復(fù)雜, 主要含有醉魚草皂苷Ⅳb[2,3]、香蜂草苷、橙皮苷、β甾醇[4]、異櫻花素-7-蕓香糖苷、芹菜素[5]、洋芹素[6]、熊果酸[7]、蒲公英賽醇[8]等成分, 其中三萜皂苷類為其主要成分。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究和臨床試驗證明, 其皂苷類成分具有治療各種出血、單純性紫癜、原發(fā)性血小板減少性紫癜等作用[9-12], 其中醉魚草皂苷Ⅳb為有效成分之一。因此, 將斷血流中醉魚草皂苷Ⅳb最大限度地提取出來，對提取物功效是具有重要現(xiàn)實意義的。

斷血流提取工藝有水提醇沉法、醇提法、加酶提取法[13]等，水提醇沉法、醇提法使用較為普遍。由于藥典未對斷血流藥材指標成分進行明確規(guī)定，對各研究的制備工藝條件優(yōu)劣無法判斷。本研究通過對中藥提取物生產(chǎn)的兩個重要階段提取和濃縮工藝進行研究，系統(tǒng)地考察了提取溶劑、提取時間各影響因素對斷血流指標成分醉魚草皂苷Ⅳb提取的影響, 擬優(yōu)選出最佳制備工藝條件, 最大程度提高斷血流提取物指標成分含量，以期為斷血流的進一步開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)和工藝參考。

1 實驗儀器與藥品試劑

1.1 實驗儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，配紫外檢測器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE52-98型，上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州萬合儀器制造有限公司)；電子分析天平(METTLER TOLEDO，ML204型)；超聲波清洗機(功率250W，頻率50kHz，廣州維力超聲電子設(shè)備有限公司)。

1.2 藥品試劑

斷血流藥材，柳州市桂中大藥房采購；醉魚草皂苷IVb對照品，中國食品藥品檢定研究所(批號：110782-200602，含量以99.5%計)；甲醇為色譜純；超純?nèi)ルx子水；食用酒精。

2 指標成分含量測定方法

2.1 對照品溶液制備

稱取醉魚草皂苷Ⅳb對照品0.0050g，精確至0.0001g，置于100mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻并使之溶解。此溶液濃度為50μg/mL，置于2℃～4℃保存。

2.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱，5μm，250×4.6mm；流動相：甲醇-水， 0min～5min，70%甲醇，5min～15min，70%～90%甲醇；檢測波長為250nm；流速1.0mL/min；柱溫30℃。

2.3 標準曲線制備

準確移取2.1對照品溶液適量以甲醇稀釋配置標準工作系列溶液，制成濃度分別為2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL。在上述2.2的色譜條件，分別取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積(見圖1)。以醉魚草皂苷Ⅳb的濃度為X軸，其相應(yīng)的峰面積為Y軸，繪制標準工作曲線。結(jié)果表明：醉魚草皂苷Ⅳb在2.5μg/mL～20μg/mL范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為：

Y=30.6701X+1.9054

r=0.9999

圖1 醉魚草皂苷Ⅳb對照品色譜圖

圖2 樣品色譜圖

2.4 樣品指標成分含量測定

將斷血流藥材按各工藝條件提取，最后濃縮制備成1∶1的斷血流提取液(一份干藥材制成一份提取物)。精密稱取0.1g提取液置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻后，用0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測樣品溶液。在上述2.2的色譜條件，精密量取20μL注入高效液相色譜儀(樣品色譜圖如圖2所示)，記錄峰面積, 用回歸方程計算樣品制備成分醉魚草皂苷Ⅳb含量即得。

3 試驗方法與結(jié)果

3.1 提取階段-單因素考察

3.1.1 提取溶劑及濃度

在考慮實際生產(chǎn)及產(chǎn)品應(yīng)用的基礎(chǔ)上，選取水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇為提取溶劑，溶劑用量10倍，分別采用加熱回流提取1h。按 2.4 項下方法制備樣品溶液，并進行測定，結(jié)果如表1所示。由結(jié)果可知,用30%乙醇與50%乙醇提取及75%乙醇、與95%乙醇提取，其指標成分含量接近，表明在30%乙醇至50%乙醇之間及在75%乙醇至95%乙醇之間其指標成分提取率差別不大。綜合考慮成本，故選取水、30%乙醇、75%乙醇作為正交試驗水平。

表1 不同提取劑濃度對斷血流提取物指標成分影響

3.1.2 料液比

稱取100g藥材5份，分別按料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14加入75%乙醇溶液，加熱回流提取 2 次，每次時間 2 h，按 2.4 項下方法制備樣品溶液，并進行測定，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，醉魚草皂苷Ⅳb隨著提取溶劑用量的增大而增加，提取越完全。綜合成本考慮，故選用料液比 1∶8、1∶10、1∶12作為正交試驗水平。

表2 不同料液比對斷血流提取物指標成分影響

3.1.3 提取時間

稱取100g藥材5份，加入10倍量75%乙醇溶液，加熱回流提取2次，提取時間分別按0.5、1.0、1.5、2.0、3.0h，按 2.4項下方法制備樣品溶液，并進行測定，結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，醉魚草皂苷Ⅳb隨著提取時間的增大而增加，1.5 h后逐漸趨于平穩(wěn)。綜合成本考慮，故選用提取時間 1.0、1.5、2.0h作為正交試驗水平。

表3 不同提取時間對斷血流提取物指標成分影響

3.1.4 提取次數(shù)

稱取100g藥材5份，加入10倍量75%乙醇溶液加熱回流提取1、2、3、4、5 次，每次提取時間為1h，按2.4項下方法制備樣品溶液，并進行測定，結(jié)果如表4所示。結(jié)果顯示，醉魚草皂苷Ⅳb隨著提取次數(shù)的增加提取越完全，2次后逐漸趨于平穩(wěn)。綜合成本考慮，故選用提取次數(shù)1、2、3次作為正交試驗水平。

表4 不同提取次數(shù)對斷血流提取物指標成分影響

3.2 提取階段——正交試驗優(yōu)選提取工藝

3.2.1 正交設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以指標成分醉魚草皂苷Ⅳb的提取率為評價指標，考察提取溶劑濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)對提取工藝的影響。按 L9(34)正交表分別進行加熱回流提取，按 2.4 項下方法制備樣品溶液，并進行測定。正交試驗因素水平見表 5，結(jié)果見表 6。

表5 實驗因素水平表

表6 正交試驗條件及結(jié)果

3.2.2 正交試驗結(jié)果分析

采用直觀分析，從表6中的極差計算結(jié)果可以看到，影響因素順序依次為 A>B>C>D，溶劑濃度(A)為主要因素，且A3>A1>A2，故選其最優(yōu)水平A3；料液比(B)為次要因素，且B3>B2>B1,故選其最優(yōu)水平B3；提取時間(C)C3>C2>C1，故選擇提取時間C3；提取次數(shù)(D)極差較小，從極差分析D2優(yōu)于D1與D3，故選擇提取次數(shù)D2。因此最佳提取工藝為A3B3C3D2，即以斷血流藥材12倍量的75%乙醇加熱回流提取2次，每次2.0h。

3.2.3 驗證試驗

稱取3份斷血流藥材，每份100g，依據(jù)正交試驗結(jié)果的最佳提取工藝，平行實驗3次，測定提取液中指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量。結(jié)果分別為668μg·g-1，689μg·g-1， 697μg·g-1。由此可知，在最佳試驗工藝條件下，提取物指標成分含量相近，表明該工藝穩(wěn)定可行。

3.3 濃縮階段

以上述確定的最佳提取工藝條件對斷血流進行提取，得到的提取液作為下述試驗的樣品。

3.3.1 濃縮方式

在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，采用常壓加熱濃縮和減壓加熱濃縮(-0.08～-0.09MP)兩種濃縮方式，以提取物指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量為依據(jù)，在60℃下濃縮2h，并進行3組平行實驗。按 2.2項下色譜條件進行測定，結(jié)果如下表7所示。結(jié)果顯示，采用常壓加熱濃縮方式斷血流提取物中醉魚草皂苷Ⅳb含量較減壓加熱濃縮高23%左右；說明在同樣的條件下，常壓加熱濃縮更有利于斷血流指標成分留存。故選擇常壓加熱濃縮方式。

表7 不同濃縮方式對斷血流提取物指標成分影響

3.3.2 濃縮溫度

采用常壓加熱濃縮，分別控制濃縮溫度在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下，濃縮時間為2h；濃縮結(jié)束后按濃縮液的量換算成1∶1的提取物測定指標成分含量。按 2.2項下色譜條件進行測定，結(jié)果如下表8所示。結(jié)果顯示，隨著濃縮溫度的升高，斷血流提取物中醉魚草皂苷Ⅳb含量也隨之提高，溫度提高到90℃后，含量提高趨勢趨于平緩。因此，將濃縮溫度控制在90℃較為合適。在提取液提取工藝條件相同的條件下，提取液中醉魚草皂苷Ⅳb含量應(yīng)恒定在一定量，但卻出現(xiàn)隨著濃縮溫度上升醉魚草皂苷Ⅳb含量增加的情況，說明斷血流提取液中存在其他與醉魚草皂苷Ⅳb結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，在高溫下轉(zhuǎn)變?yōu)樽眙~草皂苷Ⅳb，使其含量提高。

表8 不同濃縮溫度對斷血流提取物指標成分影響

3.3.3 濃縮時間

采用常壓加熱濃縮，分別控制濃縮時間為1h、2h、3h、4h、5h下，濃縮溫度為100℃；濃縮結(jié)束后按濃縮液的量換算成1∶1的提取物測定指標成分含量。按 2.2項下色譜條件進行測定，結(jié)果如下表9所示。結(jié)果顯示，斷血流提取物中醉魚草皂苷Ⅳb含量隨著濃縮時間的增大而提高，濃縮時間到4小時后，含量趨于平穩(wěn)。因此，綜合考慮生產(chǎn)效率幾能耗，將濃縮時間控制在4h較為合適。在提取液提取工藝條件相同的條件下，提取液中醉魚草皂苷Ⅳb含量應(yīng)恒定在一定量，但卻出現(xiàn)隨著濃縮時間上升醉魚草皂苷Ⅳb含量增加的情況，與隨濃縮溫度提高其含量也隨之提高一樣，說明斷血流提取液中存在其他與醉魚草皂苷Ⅳb結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，濃縮時間延長提高了轉(zhuǎn)化率，從而使醉魚草皂苷Ⅳb含量隨之提高。

表9 不同濃縮時間對斷血流提取物指標成分影響

3.3.4 驗證試驗

取在最佳提取工藝條件下提取的斷血流提取液3份，采用常壓加熱濃縮進行3次平行試驗，控制濃縮時間為4h，濃縮溫度為90℃，最后將濃縮液調(diào)成1∶1的提取物；測定提取物中指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量。結(jié)果分別為1702μg·g-1，1657μg·g-1， 1715μg·g-1。由此可知，在采用常壓加熱濃縮，濃縮時間為4h，濃縮溫度為90℃時，提取物指標成分含量較高且相近，表明該濃縮工藝穩(wěn)定可行。

3.4 工藝對比試驗

將本文研究得出的最佳提高斷血流提取物指標成分提取濃縮工藝(A:75%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶12、加熱回流提取2次，每次2h；提取液采用常壓加熱濃縮，濃縮溫度為90℃，濃縮時間為4h。)與其它研究工藝(B：75%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶10、加熱回流提取2次，每次2.5h；提取液采用減壓加熱濃縮(-0.08～-0.09MP)，濃縮溫度為60℃，濃縮時間為3h。

取斷血流藥材6份，每份100g，按上述兩種工藝方法進行3次平行試驗，結(jié)果如表10所示，采用工藝方法A制備斷血流提取物，其指標成分較工藝方法B提高了三倍。結(jié)果表明，本研究的斷血流提取濃縮工藝，能顯著的提高其指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量。

表10 工藝對比試驗結(jié)果

4 結(jié)論

本研究優(yōu)化了中藥斷血流提取物的制備工藝，以提高其指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量為主要目的。對制備工藝的提取階段和濃縮階段進行了考察，采用正交試驗優(yōu)化了提取階段的最佳工藝：75%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶12、加熱回流提取2次，每次2h；并對濃縮階段的濃縮方式選擇及其影響因素分別進行了試驗，得出了最佳濃縮工藝方法：采用常壓加熱濃縮，濃縮溫度為90℃，濃縮時間為4h；最后通過工藝對比試驗驗證，結(jié)果表明，本研究的斷血流提取濃縮工藝，能顯著的提高其指標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量，較對比工藝含量提高了3倍，該工藝穩(wěn)定可行，適應(yīng)大生產(chǎn)要求。但斷血流提取物其標成分醉魚草皂苷Ⅳb含量在濃縮階段隨濃縮條件變化而顯著變化的原因，還有待進一步深入研究。