透明質(zhì)酸在牙膏中的應(yīng)用

許海燕 王海英 肖小紅 毛 華 陳玉娟 謝玲玉

(1.江西誠(chéng)志日化有限公司，江西 南昌 330013 2.華熙生物科技股份有限公司，山東 濟(jì)南 250101)

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)又稱玻尿酸，是天然存在于生物體內(nèi)的糖胺聚糖中的一種，屬于酸性黏多糖，由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖為雙糖單位重復(fù)連接組成的直鏈大分子多糖， 相對(duì)分子量為(10～200)×104Da。透明質(zhì)酸廣泛存在于人體的表皮與真皮之中，填充在細(xì)胞間的胞外基質(zhì)內(nèi)。人體內(nèi)多種細(xì)胞如上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等都能合成HA并釋放到細(xì)胞外，其廣泛分布在人體各個(gè)組成部分，如玻璃體、滑液、軟骨、皮膚、臍帶、口腔黏膜等[1]，與膠原蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素一起構(gòu)成基質(zhì)的主要成分，在人體中發(fā)揮著重要作用[2]。

幾十年來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)HA的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生理功能已有明確的認(rèn)識(shí)，在醫(yī)藥領(lǐng)域和食品領(lǐng)域有著大量應(yīng)用研究。牙膏的清潔護(hù)理作用是預(yù)防口腔疾病的重要而有效的手段，提倡通過(guò)刷牙并使用合適的牙膏，提高口腔的健康程度。對(duì)于常見的口腔問題——牙齦炎，目前輔助減輕牙齦炎癥的牙膏，一般配入的活性功效成分的原料，常用的有各種具抑菌作用的提取物、抗纖維蛋白溶酶成分、收斂劑、活血?jiǎng)┑?。?guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，透明質(zhì)酸在口腔領(lǐng)域也具有強(qiáng)大的生理活性：透明質(zhì)酸具有抗炎和抗感染以及促進(jìn)牙周組織修復(fù)重建和創(chuàng)傷愈合的作用，比如慢性牙周炎患者在機(jī)械治療或牙周手術(shù)后，局部輔以HA凝膠可阻止牙周組織的破壞，減輕牙齦炎癥，促進(jìn)牙周組織的恢復(fù)[3]；吳亞菲等研究了單獨(dú)應(yīng)用HA凝膠治療菌斑性牙齦炎，HA可以明顯地緩解牙齦炎癥[4]；高相對(duì)分子質(zhì)量的HA可抑制牙齦上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等的增殖，縮短牙周炎的炎癥過(guò)程，改善病損區(qū)狀況[3]；在口腔潰瘍方面，HA也具有保護(hù)黏膜的作用，Nolan等[5]用0.2%的HA凝膠治療復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍，每日2～3次，可立即減輕癥狀，促進(jìn)潰瘍愈合。作為牙周結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分的HA，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的水合作用，在臨床上發(fā)揮著保水和潤(rùn)滑以及調(diào)節(jié)滲透壓等作用，能保護(hù)正常細(xì)胞免受毒性細(xì)胞和自由基等的侵襲，刺激細(xì)胞遷移、黏附、增殖和分化[6]，從而達(dá)到抗炎和抗水腫作用。

透明質(zhì)酸還有很好的應(yīng)用安全性。在全世界范圍內(nèi)，許多國(guó)家已經(jīng)將透明質(zhì)酸作為食品添加劑應(yīng)用到食品的制作中。日本制定了明確的食品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，將透明質(zhì)酸加入到食品添加劑的目錄中，并將透明質(zhì)酸廣泛應(yīng)用于人們?nèi)粘Ｉ钏璧钠胀ㄊ称分?，例如以酸奶、果汁、綠茶、碳酸飲料為代表的飲品，以軟糖、果凍為代表的休閑食品，還有以沙拉醬、果醬、蜂蜜為代表的調(diào)味品等。中、美、韓等國(guó)家已將透明質(zhì)酸應(yīng)用于食品制作中，2008年5月國(guó)家衛(wèi)生部按照《新資源食品管理辦法》發(fā)布12號(hào)公告，批準(zhǔn)透明質(zhì)酸鈉作為新資源食品用作保健食品原料，87%含量的透明質(zhì)酸每日可食用量小于等于200mg。

因此，關(guān)注透明質(zhì)酸在口腔中的功效作用，研究其在牙膏中的應(yīng)用很有必要，而且透明質(zhì)酸的高保濕性也很有利于其在牙膏中的應(yīng)用。透明質(zhì)酸分子在水溶液中高度伸展，并相互纏繞連接，形成連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而水分子則在此網(wǎng)絡(luò)內(nèi)通過(guò)極性鍵和氫鍵與透明質(zhì)酸分子結(jié)合，使得透明質(zhì)酸能吸收和保持其自身質(zhì)量1000倍的水分[7]。透明質(zhì)酸的高保濕性能可增強(qiáng)牙膏的保濕作用。目前透明質(zhì)酸在牙膏中應(yīng)用研究還不多，本研究探討其抗炎修復(fù)作用的有效性及在牙膏中應(yīng)用的穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及儀器

透明質(zhì)酸Biomoist?，華熙生物科技股份有限公司；人牙齦成纖維細(xì)胞(HGF-1)，上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)公司；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，賽默飛世爾科技；IL-6 ELISA Kit，北京四正柏生物科技有限公司；牙膏用水合硅石，廣州市飛雪化工有限公司；牙膏用二水磷酸氫鈣，云南天創(chuàng)化工有限公司；牙膏用碳酸鈣，廣州滿庭芳有限公司；甘油，豐益油脂科技有限公司；丙二醇，陶氏化學(xué)(中國(guó))有限公司；山梨醇，山東天力有限公司；羧甲基纖維素鈉，江蘇常熟威怡科技有限公司；卡拉膠，F(xiàn)MC(上海)公司；黃原膠，淄博中軒生化有限公司；月桂醇硫酸酯鈉，東明俱進(jìn)化工有限公司；月桂酰肌氨酸鈉，上海奧利化工有限公司；椰油酰基丙基甜菜堿，德國(guó)贏創(chuàng)有限公司；糖精鈉，天津長(zhǎng)捷化工有限公司；三氯蔗糖，安徽金禾實(shí)業(yè)有限公司；薄荷香精，上海云峰香精香料有限公司；尼泊金甲酯鈉，無(wú)錫陸氏食品添加劑有限公司；苯氧乙醇，德國(guó)舒美有限公司；磷酸二氫鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；透明質(zhì)酸對(duì)照品，華熙生物科技股份有限公司，含量 100.7%；透明質(zhì)酸酶，華熙生物科技股份有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

倒置顯微鏡，OLYMPUS，CKX41；超凈工作臺(tái)(SCB-1520)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，SANYO，MCO-18AIC(UV)；數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市中大儀器廠；酶標(biāo)儀，BIO-RAD，iMark；0.0001g電子分析天平，梅特勒-托利多XPE204 ；0.01g電子分析天平，上海信衡電子有限公司；牙膏真空制膏機(jī)ZG05，江蘇華陰成套設(shè)備廠；軟管焊條封尾機(jī)：自制；牙膏軟管，上海三櫻包裝材料有限公司；pH計(jì)，梅特勒S400 SevenExcellenceTMpH/mV；恒溫培養(yǎng)箱，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；安捷倫高效液相色譜儀1200，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 透明質(zhì)酸對(duì)人牙齦細(xì)胞炎性因子分泌的影響實(shí)驗(yàn)

通過(guò)以人牙齦細(xì)胞(HGF-1)為模式細(xì)胞，通過(guò) LPS 刺激，使其分泌炎性因子，使用對(duì)照品及含 Biomoist?的受試樣品進(jìn)行處理，通過(guò)定量檢測(cè)炎性因子的表達(dá)，考察透明質(zhì)酸Biomoist?對(duì)炎性因子釋放的抑制作用。

LPS 溶液制備：用無(wú)血清 DMEM 培養(yǎng)液配制濃度為 50 萬(wàn)單位/mL 的母液，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，-20℃冰箱保存，臨用前稀釋成 1 萬(wàn)單位/mL 的作用液。

透明質(zhì)酸Biomoist?受試樣品的制備：使用 1 萬(wàn)單位/mL 的 LPS 溶液配制濃度為 0.2%的 Biomoist?溶液，過(guò)濾除菌，即為受試樣品。

對(duì)照品制備：使用不含血清的 DMEM 培養(yǎng)液作為對(duì)照品。

將人牙齦細(xì)胞(HGF-1)以 5×105個(gè)/mL接種于 24 孔板，在 37℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 24h，分別加入透明質(zhì)酸Biomoist?受試樣品溶液、LPS 溶液(陽(yáng)性對(duì)照)和對(duì)照品溶液(陰性對(duì)照)各 1mL，繼續(xù)培養(yǎng) 24h，用 ELISA 試劑盒檢測(cè)炎性因子。操作過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 透明質(zhì)酸對(duì)人牙齦細(xì)胞的創(chuàng)傷修復(fù)作用實(shí)驗(yàn)

考察透明質(zhì)酸Biomoist?對(duì)牙齦細(xì)胞的創(chuàng)傷修復(fù)作用。采用體外模擬傷口愈合采用細(xì)胞劃痕法，它是簡(jiǎn)便快捷測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的方法。在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的單層人牙齦細(xì)胞(HGF-1)細(xì)胞上，用微量槍頭在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后與對(duì)照品及含透明質(zhì)酸Biomoist?的受試樣品接觸，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間，拍照觀察周邊細(xì)胞是否生長(zhǎng)遷移至中央劃痕區(qū)，以此判斷細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移能力。

透明質(zhì)酸Biomoist?受試樣品的制備：用不含血清的 DMEM 培養(yǎng)液配制濃度為 0.2%的透明質(zhì)酸Biomoist?溶液，過(guò)濾除菌，即為受試樣品。

對(duì)照品制備：使用不含血清的 DMEM 培養(yǎng)液作為對(duì)照品。

鋪板：以 1×105個(gè)/mL 的密度將人牙齦細(xì)胞(HGF-1)接種于 24 孔板，每孔 1mL，37℃、 5% CO2條件下培養(yǎng) 24h。

劃痕：用 10μL槍頭垂直方向在細(xì)胞內(nèi)劃線，拍照記錄劃線后細(xì)胞分布與形態(tài)。

加藥：棄去板中液體，分別加入透明質(zhì)酸Biomoist?受試樣品溶液和對(duì)照品溶液，每孔 1mL，繼續(xù)培養(yǎng) 24h、48h 后拍照對(duì)比觀察。

使用 SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，顯著性差異的有效值定為*P值<0.05，**P值<0.01 。

1.2.3 透明質(zhì)酸在牙膏中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

根據(jù)透明質(zhì)酸的抗炎修復(fù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將0.45%用量的透明質(zhì)酸添加入牙膏的基質(zhì)中，進(jìn)行牙膏樣品制備。

牙膏按磨擦劑的類型分為二氧化硅型、碳酸鈣型、磷酸氫鈣型，按照一般牙膏配方原則，將透明質(zhì)酸加入3個(gè)體系的牙膏基礎(chǔ)配方中，同時(shí)加入不同的表面活性劑和防腐劑，觀察配方中各原料的配伍穩(wěn)定性和透明質(zhì)酸含量穩(wěn)定性，具體配方如表1含透明質(zhì)酸Biomoist?的牙膏配方。

(1)液料制備：常溫下將功效劑透明質(zhì)酸Biomoist?、甜味劑、防腐劑加入配方量的水中進(jìn)行分散溶解后加入真空制膏機(jī)中，再計(jì)量稱取所需保濕劑加入真空制膏機(jī)中，開啟攪拌器攪拌2min混合均勻。作為液體混合物待用；

(2)粉料制備：按計(jì)量稱取所需磨擦劑、粘合劑、發(fā)泡劑，在2L燒杯中用玻璃棒手工略攪拌1min。作為粉料混合物待用；

(3)液料和粉料混合：將制備好的粉料混合物加入真空制膏機(jī)的液料混合物中，攪拌20min；

(4)按計(jì)量稱取所需芳香劑薄荷香精，加入真空制膏機(jī)的混合物中，攪拌10min；

(5)打開制膏機(jī)的真空泵開始抽真空，真空度保持在-0.095MPa以上，12min 后關(guān)閉真空泵和攪拌器，制膏完成。

(6)灌裝樣品：膏體從真空制膏機(jī)中倒出，手工灌裝到牙膏軟管中，用自制封尾機(jī)封尾。

1.2.4 透明質(zhì)酸在牙膏中的含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

采用酶解結(jié)合高效液相外標(biāo)法檢測(cè)供試品中透明質(zhì)酸的含量。

色譜條件：色譜柱：Luna NH2(4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相：0.4mol/L NaH2PO4溶液；流速：0.6ml/min；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：232nm。

表1 含透明質(zhì)酸Biomoist?的牙膏配方

酶解緩沖液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)27.4g、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)8.8g置1000mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得 0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。上述緩沖液稀釋40倍后得到酶解緩沖液(5mM/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH=6.0)。

對(duì)照品溶液：精密稱取透明質(zhì)酸對(duì)照品約 50mg于 50mL容量瓶中，酶解緩沖液溶解并定容至刻度，混勻。取上述溶液 1.0mL置于10mL容量瓶中，加入2mL透明質(zhì)酸酶，混勻，密封，42℃酶解2h，煮沸2min使酶失活，流動(dòng)相定容至刻度，0.22μm濾膜過(guò)濾，即得對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密稱取供試品牙膏 1.0g于10mL容量瓶中，酶解緩沖液定容，混勻。取上述溶液1mL加入2mL透明質(zhì)酸酶，混勻，密封，42℃酶解2h，煮沸2min 使酶失活，流動(dòng)相定容至10mL，0.22μm 濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。

測(cè)定：分別取對(duì)照品溶液，供試品溶液20μL 進(jìn)樣，以外標(biāo)法峰面積計(jì)算供試品溶液中透明質(zhì)酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 透明質(zhì)酸對(duì)人牙齦細(xì)胞炎性因子分泌的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以 LPS 刺激人牙齦細(xì)胞(HGF-1)產(chǎn)生炎性因子 IL-6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明透明質(zhì)酸Biomoist?對(duì) IL-6 的分泌抑制率達(dá) 65.42%，具體結(jié)果見表2透明質(zhì)酸Biomoist?對(duì)炎性因子IL-6的影響。從結(jié)果可見Biomoist?可有效抑制炎性因子的產(chǎn)生，減少刺激物對(duì)口腔組織的傷害。

表2 透明質(zhì)酸Biomoist?對(duì)炎性因子IL-6的影響

2.2 透明質(zhì)酸對(duì)人牙齦細(xì)胞創(chuàng)傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)圖1可見，使用透明質(zhì)酸Biomoist?處理受損的人牙齦細(xì)胞 48h 后，受損部位幾乎完全恢復(fù)，細(xì)胞增殖率遠(yuǎn)高于對(duì)照組，表明透明質(zhì)酸Biomoist?可有效修復(fù)受損的牙齦細(xì)胞，促進(jìn)口腔組織恢復(fù)健康狀態(tài)。

圖1 透明質(zhì)酸Biomoist?對(duì)牙齦細(xì)胞的創(chuàng)傷修復(fù)作用h

2.3 含透明質(zhì)酸牙膏的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

透明質(zhì)酸是白色無(wú)味固體，有很強(qiáng)的吸濕性，溶于水不溶于有機(jī)溶劑。天然透明質(zhì)酸的雙糖單元由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺構(gòu)成，從圖2透明質(zhì)酸分子結(jié)構(gòu)圖可見，D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺之間通過(guò)β-1，3糖苷鍵相連，而雙糖單元通過(guò)β-1，4糖苷鍵連接，兩種糖均采取β構(gòu)象，其羥基、羧基、乙酰氨基、羥甲基都處在e鍵位上，使透明質(zhì)酸在能量上非常穩(wěn)定[8]。透明質(zhì)酸這種穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)有利于其在牙膏中的添加，通過(guò)對(duì)含透明質(zhì)酸牙膏樣品進(jìn)行理化指標(biāo)檢測(cè)，表明即使將牙膏在40℃烘箱中老化90天后，其性質(zhì)依然很穩(wěn)定，各項(xiàng)理化指標(biāo)也是符合GB/T8372-2017牙膏國(guó)標(biāo)的。

圖2 透明質(zhì)酸分子結(jié)構(gòu)圖

表3 含透明質(zhì)酸牙膏的理化指標(biāo)表

2.4 透明質(zhì)酸在牙膏中的含量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 不同配方類型牙膏中透明質(zhì)酸含量測(cè)試結(jié)果

透明質(zhì)酸在牙膏中的初始加入濃度為0.45%，但是加入牙膏后檢測(cè)含量略有下降，在不同牙膏中為2.2%～6.7%不等。40℃烘箱90天加速實(shí)驗(yàn)顯示其降解率在4.76%～9.1%之間。一般認(rèn)為活性成分在保質(zhì)期內(nèi)降解率控制在10%內(nèi)是可以接受的，目前僅用加速老化實(shí)驗(yàn)?zāi)M保質(zhì)期，具體保質(zhì)期內(nèi)透明質(zhì)酸含量的穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步在2～3年實(shí)際儲(chǔ)存條件下研究考察。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明0.2%的透明質(zhì)酸Biomoist? 對(duì) IL-6 的分泌抑制率達(dá) 65.42%，透明質(zhì)酸可有效抑制炎性因子的產(chǎn)生，減少刺激物對(duì)口腔組織的傷害；使用透明質(zhì)酸Biomoist?處理受損的人牙齦細(xì)胞48h后，受損部位幾乎完全恢復(fù)，細(xì)胞增殖率遠(yuǎn)高于對(duì)照組，表明透明質(zhì)酸Biomoist?可有效修復(fù)受損的牙齦細(xì)胞，促進(jìn)口腔組織恢復(fù)健康狀態(tài)。通過(guò)考察透明質(zhì)酸在不同pH體系的牙膏配方(碳酸鈣型、磷酸氫鈣型、二氧化硅型)中的理化指標(biāo)和含量，表明透明質(zhì)酸具有良好的配伍穩(wěn)定性，牙膏的理化性質(zhì)穩(wěn)定，透明質(zhì)酸的含量也沒有出現(xiàn)明顯下降現(xiàn)象。

生物制劑向日用品應(yīng)用延伸是未來(lái)需要關(guān)注的研發(fā)方向，研究了透明質(zhì)酸水溶液對(duì)人牙齦細(xì)胞的抗炎修復(fù)作用，驗(yàn)證了透明質(zhì)酸在牙膏中的配方穩(wěn)定性和含量穩(wěn)定性，為透明質(zhì)酸這類生物制劑應(yīng)用于牙膏進(jìn)行了探索。