假博路定的鑒別研究

滕海堂，金 鵬，胡 珀，魯素雅

淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，淮安223001

恩替卡韋（entecavir）（商品名為博路定）為美國百時(shí)施貴寶公司研制開發(fā)的一種抗乙肝病毒藥物，2005 年被批準(zhǔn)在中國上市，用于治療慢性乙型肝炎（CHB），療效優(yōu)于拉米夫定[1]。

“4+7”藥品集中采購[2]之前，博路定價(jià)格較高，某些不法分子以低價(jià)之名，通過互聯(lián)網(wǎng)向患者出售假冒“博路定”以牟取暴利。為順利開展博路定的日常打假和藥品流通監(jiān)督，筆者建立了液質(zhì)聯(lián)用輔以外觀鑒別的方法，能有效辨別博路定真、偽品。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

梅特勒XS205DU 電子天平；Waters 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；薄層掃描儀、Agilent 6540 四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 藥品與試劑

博路定真品（批號(hào)AAZ5491，規(guī)格0.5 mg，中美上海施貴寶制藥有限公司）；博路定假品（批號(hào)AAN6855，規(guī)格0.5 mg，網(wǎng)購品）；恩替卡韋膠囊（批號(hào)180304，規(guī)格0.5 mg，正大天晴制藥有限公司）；阿德福韋酯片（批號(hào)201805092，規(guī)格10 mg，江蘇天士力帝業(yè)藥業(yè)有限公司）；對(duì)照品：恩替卡韋（純度93.6%，批號(hào)101248-201804），阿德福韋酯（純度98.9%，批號(hào)100576-201802），拉米夫定（純度99.7%，批號(hào)101007-201502），均購于中國食品藥品檢定研究院；富馬酸替諾福韋二吡呋酯（內(nèi)標(biāo)，純度98.0%）；富馬酸替諾福韋艾拉酚胺（內(nèi)標(biāo)，純度99.0%）。乙腈為色譜純；三氟乙酸、鹽酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥品外觀性狀鑒別[3]

真、偽品外觀的主要區(qū)別在于：內(nèi)包裝鋁塑板的鋁膜上，真品商品名處平視呈暗藍(lán)色、斜視呈亮藍(lán)色防偽變色光，企業(yè)標(biāo)識(shí)在365 nm 紫外燈下呈明顯的熒光；偽品鋁膜的商品名處無防偽變色光，企業(yè)標(biāo)志也無熒光。

2.2 實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證

2.2.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Exlend Plus C18（2.1mm×50mm，1.8μm）；以0.02mol·L-1乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B（梯度洗脫：0～5 min，99%A；5～10 min，99%A→20%A；10～11 min，20%A）；檢測(cè)波長：254 nm；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL·min-1。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子檢測(cè)，毛細(xì)管電壓：4000 V，錐孔電壓：65 V，離子源溫度：350 ℃，干燥氣流速：10 L·min-1，掃描范圍：50～1000 m/z，掃描方式：一級(jí)質(zhì)譜全掃描、二級(jí)質(zhì)譜全掃描，碰撞能量：10～35 V。

2.2.3 測(cè)定方法 分別取對(duì)照品恩替卡韋、阿德福韋酯各約20 mg，置100 mL 量瓶中，加甲醇20 mL 溶解，放冷后加入0.01 mol·L-1鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻。精密量取5 mL，置100 mL 量瓶中，加0.01 mol·L-1鹽酸溶液至刻度，搖勻，即得。

取偽品1 片研磨成粉，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加0.01 mol·L-1鹽酸溶液適量，超聲溶解，放冷，0.01 mol·L-1鹽酸定容至刻度，搖勻，取溶液適量，以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，濾過，即得。

精密量取對(duì)照品溶液和偽品溶液各1 μL，注入液-質(zhì)聯(lián)用儀，記錄液相色譜圖（見圖1）和一、二級(jí)質(zhì)譜圖（見圖2）。

2.2.4 檢測(cè)結(jié)果 從圖1、圖2 看出，在博路定偽品色譜中，檢出與阿德福韋酯對(duì)照品色譜保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖一致的色譜峰（見表1）。

表1 阿德福韋酯對(duì)照品和博路定偽品色譜的保留時(shí)間及一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜特征

2.2.5 檢測(cè)篩查其他抗乙肝藥物 以上述方法為基礎(chǔ)建立質(zhì)譜同時(shí)鑒別幾種抗乙肝藥物方法，結(jié)果如圖3、圖4。

由以上幾種抗乙肝藥的液相色譜圖、質(zhì)譜圖，可在一定范圍內(nèi)與偽品比對(duì)，明確其是何種成分。

3 討論

藥品外觀鑒別是現(xiàn)階段用來鑒別偽藥的初始方法，包括內(nèi)外包裝、防偽特征和藥品性狀等。這種方法相對(duì)比較粗淺簡單，還要依賴于患者長期服用的這種藥品，且對(duì)該藥外觀有著清楚的了解方可感知。筆者發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有博路定偽藥外包裝真假無明顯差異，而內(nèi)包裝差異性很大，很可能制假者從患者等途徑回收的外包裝和說明書，然后再壓制普通包衣片，實(shí)現(xiàn)造假源頭的第一步。但是內(nèi)包裝防偽標(biāo)識(shí)為企業(yè)核心技術(shù)，生產(chǎn)企業(yè)因涉密未公開，這也是制假者的最大缺陷漏洞。因此，患者、藥品監(jiān)督人員及流通單位人員可以利用外觀初步辨別真、偽藥品。

近紅外光譜法[4]是十分常見的快速檢驗(yàn)方法，其最大的優(yōu)勢(shì)為取樣少、無損傷，不僅能夠檢查藥品制劑中活性成分，還能檢測(cè)輔料不同的形態(tài)以及種類，如原料藥、蛋白質(zhì)、中草藥、膠囊、片劑、分散片等[5]。同品種、同劑型因不同廠家生產(chǎn)工藝及輔料差異而呈現(xiàn)出不同NIR 光譜。目前國內(nèi)恩替卡韋片主要由中美上海施貴寶制藥有限公司和北京百奧藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，本文只收集到前者的博路定（恩替卡韋片），由于批次少，廠家少，故未能建立有效博路定近紅外相關(guān)系數(shù)模型。有待國家局藥品近紅外一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蛶鞌?shù)量增大、覆蓋面進(jìn)一步完善，滿足基層藥監(jiān)快檢需求。

液質(zhì)聯(lián)用儀能夠精準(zhǔn)地定性定量分析待測(cè)物，尤其未知樣品。對(duì)未知物通過質(zhì)譜解析快速判定分子量和分子式，有利于定位可能的化合物。通過比對(duì)可能的對(duì)照譜圖，具體明確添假、摻假成分。本文僅研究5 種抗乙肝藥物，有老藥，也有目前一線藥物，還有未上市新藥，具有典型性，但未能囊括抗乙肝類藥物，有待進(jìn)一步擴(kuò)大范圍，提高檢驗(yàn)覆蓋面。