臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療CIA 大鼠的療效觀察*

姚 瑤，葛衛(wèi)紅，曹 娟，丁從珠**

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 1 藥學(xué)部；2 老年科，南京210008

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因不明的自身免疫疾病，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率約為0.5%，在我國為0.4%，炎癥和骨破壞為RA 的兩大主要病理表現(xiàn)[1]。目前的治療藥物僅能改善病情進(jìn)展，不能治愈疾病。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多項(xiàng)分化潛能的多能干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的免疫抑制和誘導(dǎo)免疫耐受功能，表現(xiàn)出抑制炎癥增殖的特性，能夠改善免疫系統(tǒng)紊亂引起的慢性炎癥。MSC 已陸續(xù)在美國、加拿大、韓國、瑞士和日本等9 個(gè)國家批準(zhǔn)上市，用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫疾病[2]；但是它對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療仍存爭議。本研究即通過體內(nèi)研究，觀察MSC 治療膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠的效果，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡SPF 級(jí)健康SD 大鼠50 只，雌性，體質(zhì)量150～170 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可：SCXK（京）2016-0011，南京鼓樓醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 天后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器和試劑

水平式離心機(jī)（美國Wealtec 公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；超凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠）；病理組織切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）。

細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶、青鏈霉素（批號(hào)：12100046、25200-056、15070063，均 為GIBCO 公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料公司）；甲氨蝶呤（MXT，陽性對(duì)照藥，批號(hào)：170102，上海信誼藥業(yè)）；II 型膠原酶、白介素-17（IL-17）、NFκB 配位體受體活化劑（RANKL）、可溶性蛋白骨保護(hù)素（OPG）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）試劑盒（均美國Sigma 公司）。

1.3 間充質(zhì)干細(xì)胞制備

經(jīng)知情同意后取得人源臍帶，無菌條件下浸入DMEM/F12 培養(yǎng)液中，超凈工作臺(tái)內(nèi)PBS 沖洗，將臍帶剪碎至1～2 mm3組織塊，轉(zhuǎn)移至0.075%膠原酶Ⅱ溶液中，37 ℃攪拌消化30 min，PBS 再次清洗后，用0.125%胰酶37 ℃消化30 min。100 μm 細(xì)胞篩過濾，濾液離心，PBS 沖洗2 次。以1.0×106/cm2的密度接種于含L-DMEM 培養(yǎng)液的塑料培養(yǎng)瓶中，3～4 天更換培養(yǎng)液，去掉未貼壁細(xì)胞，以后每3 天換液1次。待細(xì)胞生長到80%左右融合時(shí)，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長形態(tài)，確認(rèn)細(xì)胞狀況良好，符合移植要求后，以0.25%胰蛋白酶/EDTA 混合液消化，再用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液清洗2～3 次，制成1.0×106/mL 細(xì)胞懸液以備移植用。

1.4 大鼠關(guān)節(jié)炎模型的制備

50 只SD 大鼠稱重后，隨機(jī)分為空白組10 只，其余40 只造模。將溶于醋酸的Ⅱ型膠原酶先于4 ℃低溫保存過夜，第二天與完全弗氏佐劑以等體積乳化。乳化成功后，對(duì)擬造模的大鼠背部及尾部多點(diǎn)皮下注射，每只注射0.15 mL，誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型。首次注射的7 天后進(jìn)行第二次注射，方法與首次注射相同?？瞻讓?duì)照組按照相同方法注射等量0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）。

1.5 關(guān)節(jié)評(píng)分

首次免疫注射后每3 天稱重1 次，每次固定兩名實(shí)驗(yàn)員記錄關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分。關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分為關(guān)節(jié)處無腫脹；1 分：趾關(guān)節(jié)微腫；2 分：趾關(guān)節(jié)及足趾處發(fā)生腫脹現(xiàn)象；3 分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪發(fā)生腫脹現(xiàn)象；4 分：全部足爪腫脹（包括踝關(guān)節(jié)）。最終分?jǐn)?shù)為大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹分?jǐn)?shù)的總和，最高分為16 分。

1.6 藥物治療方案

首次免疫注射后第10 天關(guān)節(jié)腫脹大于4 分的大鼠認(rèn)為造模成功，將成模大鼠隨機(jī)分為：①M(fèi)SC治療組，予大鼠尾靜脈注射1×106個(gè)MSC[3]；②模型組，予大鼠尾靜脈注射等體積的生理鹽水；③MTX陽性對(duì)照組，灌胃給予MTX（3.8 mg·kg-1），每周一次。④設(shè)空白組，于正常的SD 大鼠尾靜脈注射等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)共持續(xù)治療4 周。為了評(píng)估MSC 的短期和長期治療效果的差異，另設(shè)MSC 7天治療組。

1.7 炎癥因子測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食一夜，次日于大鼠眼眶取血，ELISA 法測定血清中IL-17、RANKL、TGF-β 以及OPG 水平，按試劑盒說明書操作。

1.8 組織HE 染色

實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠，分離大鼠后足關(guān)節(jié)，標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 切片，HE染色。醫(yī)學(xué)顯微鏡下作組織學(xué)觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析，最小顯著差數(shù)（LSD）法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)炎評(píng)分

每3 天由兩名實(shí)驗(yàn)員分別對(duì)大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)評(píng)分一次，得分取平均值，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行4 周，關(guān)節(jié)炎評(píng)分走勢圖見圖1。

因藥物治療效果有一定的延遲，在治療10 天左右，關(guān)節(jié)評(píng)分達(dá)到一個(gè)高峰，之后模型組評(píng)分也略有下降；但MSC 尾靜脈輸注和甲氨蝶呤灌胃均可以降低CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分。實(shí)驗(yàn)完成前模型組關(guān)節(jié)炎評(píng)分為8.8±1.3，MSC 組為2.4±1.1，顯著低于模型組（P＜0.05）；MTX 治療組關(guān)節(jié)炎評(píng)分為2.6±0.9；表明降低關(guān)節(jié)炎的作用，MSC 組與陽性對(duì)照MTX組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 大鼠血清細(xì)胞因子測定

CIA 大鼠尾靜脈輸注MSC 治療RA（106個(gè)/只），實(shí)驗(yàn)結(jié)束測定大鼠血清中IL-17、RANKL、OPG、TGF-β、OPG 等細(xì)胞因子水平，見表1。

表1 各組大鼠血清IL-17、RANKL、TGF-β 水平（n=8）

以模型組和空白組作對(duì)照，甲氨蝶呤為陽性對(duì)照。結(jié)果提示：①模型組IL-17、RANKL、TGF-β 水平高于空白組（P＜0.05），驗(yàn)證造模成功。②經(jīng)治療，與模型組相比，MSC 組顯著降低RANKL、TGF-β 水平，顯著提高OPG 水平（P＜0.05）。③MSC 組對(duì)IL-17 的降低作用弱于甲氨蝶呤組，且僅維持較短時(shí)間，對(duì)OPG 的提高作用強(qiáng)于甲氨蝶呤組。

2.3 關(guān)節(jié)HE 染色

HE 染色結(jié)果顯示（見圖2），模型組關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞侵潤，已將腔隙填滿（圖2A），且血管翳清晰；空白組（圖2B）邊界清晰，軟骨完好；MSC 治療7 天組軟骨組織完好，但間隙狹窄（圖2C）；MSC 治療28 天組（圖2D）與空白組差異小，且與MTX 組（圖2E）效果相當(dāng)。

3 討論

目前RA 的治療主要為改善病情的抗風(fēng)濕藥（DMARDs），傳統(tǒng)DMARDs 有甲氨蝶呤，為國內(nèi)外“指南”推薦的一線治療藥物；但是藥物起效慢、個(gè)體差異大、不良反應(yīng)多。近年來TNF-α 抑制劑Etanercept、IL-6 受體拮抗劑Tocilizumab 等生物抗風(fēng)濕藥應(yīng)用于臨床，可有效改善病情；但仍有近1/3 的患者不能從中獲益，更棘手的是，疾病早期即可出現(xiàn)關(guān)節(jié)破壞，一旦發(fā)生，尚無有效的恢復(fù)途徑，因此亟需探索修復(fù)RA 關(guān)節(jié)損傷的新型療法。MSC 是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，可在特定條件下分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)元等，是組織修復(fù)的重要細(xì)胞；MSC 還兼有免疫抑制、抗炎、抗纖維化等功效。以此為基礎(chǔ)，MSC 移植治療組織損傷和自身免疫性疾病成為研究熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果提示，MSC 與MTX 治療效果相近，均能有效改善CIA 大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)。Wang YH等[4]的研究顯示，MSC 能夠有效改善CIA 大鼠癥狀，且與MTX 聯(lián)用可以提高治療效果。邊振宇[5]作RA大鼠模型實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)、經(jīng)靜脈全身性注射以及關(guān)節(jié)內(nèi)注射聯(lián)合靜脈全身注射MSC，結(jié)果表明，3 種方式均可降低RA 模型的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，聯(lián)合治療效果更佳。與本研究結(jié)果吻合。

既往的研究提示，MSC 可以通過調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，具體表現(xiàn)為抑制T 淋巴細(xì)胞的增殖和活化[6]，這可能也是其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要機(jī)制之一。MSC 通過抑制細(xì)胞分裂，使T淋巴細(xì)胞阻滯于G0/G1 期，一是通過細(xì)胞間相互作用；二是通過可溶性細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)，MSC 分泌的可溶性細(xì)胞因子（TGF-β、HGF、IL-6、IL-10、PGE2、NO、IDO 等）作用于T 淋巴細(xì)胞間抑制其增殖能力與活性[7]。對(duì)于TGF-β 的研究爭議較多，既往認(rèn)為它是一種抑炎因子。趙成等[8]的研究提示，MSC 可能通過抑制促炎因子IL-6、IL-1 和TNF-α，以及上調(diào)抑炎因子TGF-β 來發(fā)揮抗炎作用。但是，近年來的研究卻又指出，TGF-β 參與RA 滑膜成纖維細(xì)胞的遷移和浸潤，是導(dǎo)致RA 發(fā)病的重要炎癥因子[9]。Liu Y 等[10]的研究提示，MSC 主要是通過抑制TGF-β 分泌，抑制T 細(xì)胞活性，發(fā)揮治療RA 的作用。在本研究中，MSC 尾靜脈輸注后能夠顯著降低TGF-β 水平，與Liu Y 等研究結(jié)論一致。除了滑膜成纖維細(xì)胞，Th17 細(xì)胞也是參與RA 發(fā)病的關(guān)鍵。Kim KW等[11]的研究表明，MSC 可以抑制RA 患者Th17 細(xì)胞的作用，降低IL-17 水平。但是在本研究中，治療一周后IL-17 水平顯著下降，且隨著時(shí)間的推移，MSC對(duì)IL-17 的調(diào)節(jié)作用減弱，總體效果弱于MTX，這可能與MSC 的給藥頻次和劑量有關(guān)。

MSC 除了具有免疫調(diào)節(jié)作用外，還具有多向分化潛能，是RA 組織修復(fù)的理想種子細(xì)胞[12]。本研究雖然未直接觀測到MSC 的歸巢和成骨分化，但是結(jié)果提示，MSC 能夠上調(diào)OPG 分泌，降低RANKL 的水平，從而抑制破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成。同時(shí)，從HE 染色結(jié)果看，隨著時(shí)間的推移，MSC能夠抑制關(guān)節(jié)破壞的進(jìn)程，其治療效果與MTX 類似。有研究還發(fā)現(xiàn)，MSC 常規(guī)分泌大量OPG，在向破骨細(xì)胞誘導(dǎo)體系中加入MSC 或MSC 上清液后，破骨細(xì)胞的數(shù)量及cathepsin K、NF－ATc1 等破骨細(xì)胞分化關(guān)鍵基因的表達(dá)均受到顯著抑制，這種抑制趨勢與OPG 的水平呈正相關(guān)[13]。MSC 通過持續(xù)分泌OPG，在體外有效抑制了破骨細(xì)胞的分化。以上研究一定程度表明，當(dāng)RA 急性期的強(qiáng)烈炎性反應(yīng)控制后，在慢性炎癥過程中，利用MSC 在RA 環(huán)境下成骨、軟骨再生似乎成為可能。

綜上所述，MSC 對(duì)于滑膜浸潤和骨破壞有一定的治療作用，還具有免疫調(diào)節(jié)及多向分化的雙重作用，是RA 組織修復(fù)的理想種子細(xì)胞，可能彌補(bǔ)傳統(tǒng)DMARDs 類在治療RA 時(shí)的不足。今后研究方向?qū)⒕蚆SC 的給藥方式、頻次和劑量等方面進(jìn)行深入探討，為RA 的臨床治療提供新的方法。