刺五加皂苷B/E 對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞遷移能力的影響及作用機(jī)制研究*

梁 睿，翟溯瀾，呂夢(mèng)雨，蔣艷婷，韋翠萍，郭冷秋**

1 蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院&蘇州檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215009;2 南京醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南京211166

乳腺癌是最常見(jiàn)且致死性較高的婦科腫瘤之一，其易轉(zhuǎn)移和侵襲的特點(diǎn)嚴(yán)重影響女性患者的生存期和生活質(zhì)量[1]，因此尋求安全有效地抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物顯得尤為迫切。中藥刺五加已被證實(shí)具有抗心肌缺血、抗疲勞、抗輻射以及抗多種腫瘤細(xì)胞的藥理作用[2，3]，其中刺五加皂苷是其重要的活性成分。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究指出，刺五加皂苷具有抗肝癌細(xì)胞HepG2、乳腺癌細(xì)胞MCF-7 以及胃癌細(xì)胞SGC-7901 的作用[4，5]，但通過(guò)文獻(xiàn)研究和實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用刺五加皂苷B 或E 直接殺傷乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 細(xì)胞的作用不強(qiáng)。最新研究指出，有氧糖酵解[6，7]是腫瘤細(xì)胞的主要供能方式，同時(shí)也為腫瘤提供了一個(gè)酸性環(huán)境，為其增殖、遷移和侵襲提供了能量保障，因而能夠抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解的藥物對(duì)于抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲具有重要意義。本研究初步探究了刺五加皂苷B 和E 的復(fù)合物，對(duì)人乳腺癌增殖、遷移、侵襲和糖酵解相關(guān)蛋白的影響，以期為刺五加皂苷B 和E 復(fù)合物的開(kāi)發(fā)利用及尋求抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231 細(xì)胞，購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

刺五加皂苷B（純度≥98%，批號(hào)：wkq16060805）和刺五加皂苷E（純度≥98%，批號(hào)：wkq16040502），均為四川維克奇生物科技有限公司產(chǎn)品；兩種皂苷以1∶1 混勻，成為復(fù)合物B/E，溶解于DMSO 溶液中，使用時(shí)稀釋到所需濃度。CCK8 試劑盒（批號(hào)：GB707，日本同仁公司）；胎牛血清（批號(hào)：11H228，上海依科賽公司）；DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：8117167，美國(guó)Gibco公司）；Matrigel基底膜基質(zhì)（批號(hào)：6238005，美國(guó)BD 公司）；瑞士吉姆薩染液（批號(hào)：183631，武漢賽維爾生物科技有限公司）；HK、PFK-2、Glut-4 和β-actin 一抗（美國(guó)CST 公司）；PVDF膜（美國(guó)Millipore 公司）；兔二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；所用試劑均為化學(xué)純；水為純化水。

1.3 儀器

3110 型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；Multiskan FC 多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；GelDoc 2000 凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RAD）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCK-8 法檢測(cè)刺五加皂苷B/E 對(duì)MDAMB-231 細(xì)胞增殖活力的影響

采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231 腫瘤細(xì)胞，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后離心、計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×105/mL，均勻接種每孔200 μL 懸液于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37 ℃、含5%的CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)12 h 貼壁后，各孔分別加入不同劑量的刺五加皂苷B/E（25、50、100、200、400、800 μmol·L-1）和對(duì)照溶劑組（DMSO）繼續(xù)孵育24 h，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，孵育完成后，每孔加入10 μL CCK8 試劑，置37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光度值。

2.2 細(xì)胞劃痕法檢測(cè)刺五加皂苷B/E 對(duì)MDAMB-231 細(xì)胞遷移的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，以每孔3×105個(gè)接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)基使每孔的總體積為2 mL。6 孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后棄去上清液，無(wú)菌PBS 清洗細(xì)胞兩次，清洗后用白色的10 μL 槍頭沿每孔的中線垂直劃痕。劃痕結(jié)束后，無(wú)菌PBS 繼續(xù)清洗兩次，加入2 mL 新鮮含藥的1%胎牛血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)共分4 個(gè)組：空白組、刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組，每組設(shè)置3 個(gè)平行孔。24 h 后分別于100 倍顯微鏡下拍照。通過(guò)測(cè)量剩余無(wú)細(xì)胞面積與初始劃痕傷口面積的百分比來(lái)確定傷口愈合效果。

2.3 Transwell 法檢測(cè)刺五加皂苷B/E 對(duì)MDAMB-231 細(xì)胞侵襲能力的影響

采用DMEM 培養(yǎng)基，對(duì)去生長(zhǎng)因子的Matrigel以1∶4 進(jìn)行稀釋混勻，均勻鋪被于Transwell 上室的膜表面，待鋪被完成后小心將小室置于37 ℃培養(yǎng)箱中使其凝固。取5×103個(gè)MDA-MB-231 腫瘤細(xì)胞接種在Transwell 小室的上室。實(shí)驗(yàn)共分4 個(gè)組：空白組、刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組，各組分別加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基200 μL，每組設(shè)置3 個(gè)平行孔。Transwell 下室加入含有15%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基500μL，整個(gè)體系置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使藥物充分作用于細(xì)胞。24 h后用棉簽小心將Transwell 上室中沒(méi)有遷移的細(xì)胞拭去，取出上室底部的膜，采用4%多聚甲醛固定10min，以瑞士吉姆薩染液進(jìn)行染色30min，之后置于載玻片上，在200 倍顯微鏡下隨機(jī)選5 個(gè)視野進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)視野的平均值。

2.4 乳酸試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中乳酸含量

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 腫瘤細(xì)胞，以2×105個(gè)接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（培養(yǎng)體系共計(jì)2 mL），于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行貼壁，貼壁后小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，空白組加入不含藥物的完全培養(yǎng)基2 mL，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組分別加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基2 mL，每組設(shè)置3 個(gè)平行孔。細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h 后，收集細(xì)胞上清液，按乳酸試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，即設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品0、4、8、16、32 和64 nmol·mL-1濃度，用于制備試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)設(shè)置各給藥組，精密吸取細(xì)胞上清液10 μL，加于96 孔板后，加入樣品稀釋液使終體積為50 μL。各孔再加入相應(yīng)的乳酸工作液和酶工作液，終體積為100 μL，振蕩混勻后，室溫避光孵育30 min，以空白孔調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度值。按照公式r=n/V 計(jì)算相應(yīng)的乳酸濃度

[r 為檢測(cè)孔中乳酸濃度；n 為待檢測(cè)孔的乳酸量（nmol），按乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到；V 為加入孔樣本的體積（μL）]。

2.5 PCR 檢測(cè)細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 腫瘤細(xì)胞，以2×105個(gè)接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（培養(yǎng)體系共計(jì)2mL），于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行貼壁，貼壁后小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，空白組加入不含藥物的培養(yǎng)基2 mL，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組分別加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基2 mL，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h 后棄去培養(yǎng)基，采用無(wú)菌PBS清洗3 次，加入TRIzol 提取液充分提取細(xì)胞中的總RNA。以500ng 總RNA 為模板逆轉(zhuǎn)相應(yīng)的cDNA，在熒光酶標(biāo)儀上進(jìn)行相應(yīng)的PCR 反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)量，以β 肌動(dòng)蛋白（β-Actin）作為內(nèi)參基因，計(jì)算已糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（Glut4）基因的相對(duì)表達(dá)量。

引物序列為HK：正向：5’-CAACATTCTCATCGATTTCACGAA-3’，反向：5’-GATGGCACGAACCTGTAGCA-3’；PFK2:正 向：5’-ACTGAAGGGCTCCCACGGCA-3’，反 向：5’-GGCCGCAGTTTCAGCCACCA-3’；Glut4：正向：5’-CTGCACTCCTTCTTCCCTTT-3’，反向：5’-GCCTGCACTTGAGGAGGATTT-3’；β-Actin：正向：5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’，反向：5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’。

2.6 Western Blot 法檢測(cè)糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231 腫瘤細(xì)胞，以2×105個(gè)接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（培養(yǎng)體系共計(jì)2 mL），于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，貼壁，貼壁后小心吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，空白組加入不含藥物的培養(yǎng)基2 mL，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組分別加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基2 mL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M加入相應(yīng)的DMEM 培養(yǎng)基，各處理組加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基各2 mL，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集各孔細(xì)胞，采用RIPA 細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解。BCA 法進(jìn)行蛋白定量，將蛋白與上樣緩沖液按比例混合后蒸煮制備蛋白樣品，制備結(jié)束進(jìn)行制膠和SDS-PAGE 電泳。電泳后轉(zhuǎn)膜1.5 h，脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗HK、PFK、Glut4 和β-Actin（1∶1 000 稀釋）過(guò)夜。次日，洗膜后加入二抗（1∶2 000 稀釋）孵育1.5 h，TBST 洗膜4 次，每次10 min，于凝膠成像系統(tǒng)上曝光，使用ImageJ 1.45s 軟件作灰度分析。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-Actin灰度值的灰度比值，作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

本研究結(jié)果采用Graph Pad Prism 5 軟件進(jìn)行作圖分析，采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Student-Newman-Keuls post hoc 檢驗(yàn)作組間比較。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 刺五加皂苷B/E 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞增殖活性的影響

采用CCK8 法檢測(cè)不同濃度刺五加皂苷B/E 對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 細(xì)胞增殖抑制作用。藥物處理24h 后，與空白組相比，刺五加皂苷B/E（25、50、100、200 μmol·L-1）組的吸光度值均未發(fā)現(xiàn)顯著降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），刺五加皂苷B/E（400、800 μmol·L-1）組吸光度發(fā)生明顯降低，原因并不是刺五加皂苷B/E 對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，而是由于藥物濃度影響了細(xì)胞的生存率，表明刺五加皂苷B/E 并不能直接抑制MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞的增殖。見(jiàn)圖1。

3.2 刺五加皂苷B/E 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞遷移能力的影響

鑒于刺五加皂苷B/E 在25、50、100、200 μmol·L-1的濃度下劑量不具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，因此選取50、100、200 μmol·L-13 種濃度，研究刺五加皂苷B/E 對(duì)MDA-MB-231 腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，與空白組相比，刺五加皂苷B/E（100、200 μmol·L-1）組細(xì)胞遷移距離明顯減少，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，刺五加皂苷B/E 具有潛在的抑制MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞遷移的作用。

3.3 刺五加皂苷B/E 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3種濃度組侵襲的MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，且與空白組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，刺五加皂苷B/E 具有抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲的作用。

3.4 刺五加皂苷B/E 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸含量的影響

以乳酸試劑盒對(duì)藥物處理后的細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組均能夠減低MDA-MB-231 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸的含量，且與空白組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，刺五加皂苷B/E抑制MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用，可能與降低乳腺癌細(xì)胞乳酸分泌有關(guān)。

3.5 刺五加皂苷B/E 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞HK、PFK 及Glut4 基因mRNA 表達(dá)的影響

PCR 結(jié)果顯示，刺五加皂苷B/E（50、100、200μmol·L-1）3 種濃度組均能夠降低MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞內(nèi)有氧糖酵解相關(guān)HK、PFK 及Glut4 三種基因mRNA 的表達(dá)水平，且與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

3.6 刺五加皂苷B/E 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞糖酵解相關(guān)蛋白的影響

Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，刺五加皂苷B/E（50、100、200 μmol·L-1）3 種濃度組使糖酵解相關(guān)蛋白HK、PFK 及Glut4 表達(dá)水平明顯降低，見(jiàn)圖6。PCR 和Western Blot 的結(jié)果均表明，刺五加皂苷B/E 抑制MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲作用的機(jī)制可能與抑制乳腺癌細(xì)胞有氧糖酵解相關(guān)。

4 討論

目前對(duì)女性乳腺癌的研究普遍認(rèn)為，乳腺癌細(xì)胞易轉(zhuǎn)移、侵襲的特性極大地增加了患者的死亡率。Hanahan D 等[8]認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞代謝異常，即使氧氣充足，腫瘤細(xì)胞也能夠優(yōu)先采用糖酵解，而非線粒體氧化磷酸化為其生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲等惡性生物學(xué)行為提供能量；同時(shí)糖酵解過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸也為腫瘤細(xì)胞提供了一個(gè)酸性環(huán)境，為其轉(zhuǎn)移、侵襲提供重要的環(huán)境支撐。對(duì)于侵襲能力較強(qiáng)的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，其糖酵解相關(guān)的蛋白表達(dá)是明顯上調(diào)的、且其明顯呈現(xiàn)酸性微環(huán)境，提示抑制MDA-MB-231 腫瘤細(xì)胞糖酵解過(guò)程可能成為抑制該細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲的重要方式。

鑒于本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用刺五加皂苷B 或E 單獨(dú)處理MDA-MB-231 及MCF-7 細(xì)胞，即使?jié)舛群芨呔荒軌蛞种七@些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。試驗(yàn)選取了刺五加苷B/E 混合物的3種濃度（50、100、200 μmol·L-1）進(jìn)行后續(xù)的遷移和侵襲的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，刺五加皂苷B/E 能夠明顯抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的遷移和侵襲，且具有一定的劑量依賴性。

本研究發(fā)現(xiàn)，刺五加皂苷B/E 能夠劑量依賴性的抑制腫瘤細(xì)胞乳酸的分泌，提示刺五加皂苷B/E對(duì)腫瘤細(xì)胞糖酵解具有一定的抑制作用。Glut4 是細(xì)胞表面重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，已有研究指出，惡性程度越高的腫瘤細(xì)胞表面Glut4 的表達(dá)水平也越高[9]。本實(shí)驗(yàn)表明，刺五加皂苷B/E 能夠劑量依賴性的抑制腫瘤細(xì)胞Glut4 的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞葡萄糖的攝入。在糖酵解途徑中，HK 和PFK 是兩個(gè)重要的限速酶，調(diào)控腫瘤細(xì)胞糖酵解的過(guò)程，研究結(jié)果表明，刺五加皂苷B/E 也能夠劑量依賴性的抑制HK 和PFK 的表達(dá)，提示刺五加皂苷B/E 抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解相關(guān)的Glut4、HK、PFK 和減少乳酸分泌有關(guān)。

綜上所述，刺五加皂苷B/E 具有抑制乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞遷移和侵襲的作用，其作用機(jī)制可能是調(diào)控腫瘤細(xì)胞糖酵解相關(guān)的蛋白Glut4、HK、PFK 的表達(dá)和抑制乳酸分泌相關(guān)，這提示刺五加皂苷B/E 可能成為一種潛在的糖酵解抑制劑。