三明野生蕉-1,3-葡聚糖酶Mugsp7基因克隆及其在低溫處理下的表達(dá)分析

徐小萍 謝燕萍 陳芳蘭 陳曉慧 陳裕坤 張梓浩 程春振 林玉玲 賴鐘雄

摘? 要：以三明野生蕉組培苗為材料，通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得-1，3-葡聚糖酶基因Mugsp7（-1，3-glucanase）的?cDNA?和?gDNA?序列，并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和不同低溫下的實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析，并進(jìn)一步測(cè)定8?℃處理1、2、3、4和5?d后三明野生蕉葉片-1，3-葡聚糖酶活性。結(jié)果表明：Mugsp7的?gDNA?長(zhǎng)?1132?bp，開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)984?bp，具有一個(gè)148?bp的內(nèi)含子，共編碼?327?個(gè)氨基酸。cDNA、gDNA?的登錄號(hào)分別為?KU363808和KU363809。生物信息學(xué)分析表明，Mugsp7?屬于酸性、親水、穩(wěn)定性蛋白，不具有信號(hào)肽，與小果野蕉、大葉藻、玉米、大麥、水稻等位于同一分支，與小果野蕉親緣關(guān)系較近分為一類。實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明，不同低溫處理和8?℃低溫不同時(shí)間處理下，Mugsp7?呈現(xiàn)不同表達(dá)模式，且三明野生蕉葉片-1，3-葡聚糖酶活性的測(cè)定分析也進(jìn)一步表明，Mugsp7?能進(jìn)一步響應(yīng)低溫脅迫。因此，推測(cè)?Mugsp7?在三明野生蕉抗寒響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：三明野生蕉;-1，3-葡聚糖酶;Mugsp7;基因克隆;低溫脅迫;qPCR

Abstract： The tissue culture seedlings of a wild banana germplasm from Sanming were used to clone the cDNA and gDNA sequences of β-1，3-glucanase gene Mugsp7 by RT-PCR. Bioinformatics and qRT-PCR analysis of the expression at different low temperature were also carried out， and the enzyme activity of mperatureureent lowthe leaves was further determined by treating at 8?℃ for 1， 2， 3， 4 and 5 days. The gDNA sequence of Mugsp7 was?1132?bp with an open reading frame （ORF） of 984 bp and one intron of 148 bp， which encoding?327?amino acids. Bioinformatics analysis showed that Mugsp7 was an acidic hydrophobic stable protein， and there was no signal peptide. The amino acid sequence of Mugsp7 shared significant similarity with that in Musa acuminata， Zostera marina， Maize， Hordeum vulgare L ， Oryza sativa on the same branch， and it was closely related to Musa acuminata. The expression pattern of Mugsp7 under different low temperature treatments was different， suggesting that Mugsp7 was a low temperature stress related gene.

Keywords： wild banana germplasm from Sanming; β-1，3-glucanase; Mugsp7; gene cloning; low temperature stress; qPCR

香蕉屬于芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）植物，是世界第4大糧食作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著全球氣候和壞境的變化，植物生長(zhǎng)經(jīng)常會(huì)遭受高溫、低溫、機(jī)械傷害、病原菌等不利條件影響。寒害已成為制約我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要災(zāi)害之一[1]，嚴(yán)重寒害在一定程度上可能會(huì)引起香蕉整個(gè)植株死亡，導(dǎo)致香蕉產(chǎn)量降低。福建省作為香蕉的重要產(chǎn)區(qū)，因其環(huán)境因素孕育豐富的野生蕉優(yōu)質(zhì)基因資源。但由于地處亞熱帶，經(jīng)常遭受寒害侵襲，進(jìn)而影響到香蕉的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前大量研究表明，野生蕉與栽培香蕉相比具有更強(qiáng)的抗寒性和抗病性，充分開發(fā)利用野生蕉的優(yōu)良特性，對(duì)選育抗寒性香蕉品種具有重要意義[2-5]。

β-1，3-葡聚糖酶（β-1， 3-glucanase）基因?qū)儆谔腔饷傅?7家族成員[6]，廣泛存在于植物中，已在擬南芥、田菁、可可、玉米、大葉藻、葡萄、白菜、水稻等眾多植物中克隆獲得。研究發(fā)現(xiàn)，β-1， 3葡聚糖酶除了參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[7]和逆境脅迫外[8]，還參與植物抗病[9-10]和抗寒[11]。β-1，3-葡聚糖酶是一類重要的PR蛋白[12]，其在抗病性方面的研究取得了重大進(jìn)步[13]，但對(duì)其抗寒性的研究相對(duì)較少。低溫會(huì)誘導(dǎo)一系列生理生化反應(yīng)和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)逆境蛋白，如抗凍蛋白（AFP）的產(chǎn)生提高了植物抵抗低溫的能力。AFP在魚類中第1次被發(fā)現(xiàn)，前人研究表明[14]，將抗凍蛋白基因?qū)胫参锖筇岣吡酥参锟购浴riffit等[14]經(jīng)過氨基酸的分析，證明冬黑麥3種AFP的N端序列與內(nèi)切β-1，3-葡聚糖酶具有同源性。為了改良香蕉的抗寒性，可進(jìn)一步探討野生蕉β-1，3-葡聚糖酶基因與抗寒性相關(guān)性的研究。

目前，關(guān)于香蕉β-1，3-葡聚糖酶基因（Mugsp）的克隆也有報(bào)道。張妙霞[4]對(duì)三明野生蕉β-1，3-葡聚糖酶基因抗寒機(jī)理研究表明，Mugsp基因是抗凍蛋白基因，Mugsp1蛋白是抗凍蛋白的同工酶。陳芳蘭等[3]通過克隆獲得另外5個(gè)β-1，3-葡聚糖酶基因（Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4和Mugsp5），表明β-1，3-葡聚糖酶基因均在低溫處理下增加表達(dá)量，提高了植物抵抗低溫的能力。

因此，為提高香蕉產(chǎn)量和品質(zhì)，促進(jìn)香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，選用三明野生蕉作為材料，為篩選香蕉抗寒基因資源提供良好的遺傳背景，并采用RT-PCR技術(shù)克隆得到三明野生蕉的β-1，3-葡聚糖酶基因Mugsp7。對(duì)不同低溫處理下的Mugsp7進(jìn)行定量表達(dá)分析，進(jìn)一步測(cè)定不同時(shí)間低溫處理下的三明野生蕉β-1，3-葡聚糖酶活性變化，為進(jìn)一步研究三明野生蕉β-1，3-葡聚糖酶基因在低溫下的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究克隆所用材料是為福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所繼代保存的三明野生蕉組培苗。測(cè)定β-1，3-葡聚糖酶活性所用材料為長(zhǎng)勢(shì)一致的三明野生蕉第1～2片新葉，采自園藝植物生物工程研究所香蕉種質(zhì)資源圃。

1.2? 方法

1.2.1? Mugsp7的cDNA及gDNA克隆? 以三明野生蕉組培苗葉片為材料，參照天澤試劑盒提取植物總RNA，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)?RNA?質(zhì)量，采用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定?RNA?吸光值，以?A260/A280?在?1.9～2.1?之間為宜，采用Thermo公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA[16]。采用CTAB改良法提取三明野生蕉葉片的DNA[17]。參照小果野蕉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)注釋的β-1，3-葡聚糖酶基因序列，以標(biāo)注為“GSMUA_Achr5T08100_001”的基因序列作為參考序列進(jìn)行同源克隆。采用DNAMAN?6.0?軟件，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)上、下游引物（Mu?g?sp7-F，Mugsp7-R），用于cDNA及?gDNA的克隆，PCR反應(yīng)體系延伸時(shí)間為70 s。PCR?產(chǎn)物采用?1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，采用Biomega ?PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收、TA克隆，最后進(jìn)行菌液?PCR?鑒定。菌液?PCR?產(chǎn)物經(jīng)過電泳后，選取陽性克隆子至鉑尚公司測(cè)序。利用DNAM?A?N? 6.0對(duì)克隆所得到的基因與基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.2? 生物信息學(xué)分析? 對(duì)克隆得到的基因序列和蛋白質(zhì)序列采用以下的軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，相應(yīng)的分析軟件見表1。

1.2.3? 低溫下Mugsp7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)? 根據(jù)陳芳蘭等[3]對(duì)三明野生蕉低溫響應(yīng)的研究，分別取生長(zhǎng)勢(shì)相近的三明野生蕉組培苗葉片進(jìn)行以下處理：28、20、13、4、0、?2、?4、?6?℃處理36?h，8?℃下處理0～36?h。經(jīng)過不同溫度處理后提取RNA。實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析的cDNA則參照SYBR Ex Script RT-PCR kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

在靠近序列起始密碼區(qū)域處設(shè)計(jì)定量上下游引物，引物序列見表2。將不同處理的三明野生蕉葉片?cDNA?各取1?μL進(jìn)行混樣，對(duì)混合的?c?D?N?A ??進(jìn)行?5、25、125和?625?倍的梯度稀釋，熒光定量?PCR試驗(yàn)結(jié)果顯示，E值在?1.9～2.1?之間，建立的溶解曲線。以?18?s?為內(nèi)參基因[4]，使用羅氏LightCycler? 480 system熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。以不同處理后稀釋10倍的cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量?PCR，對(duì)得到的平均?Cp?值采用單基因內(nèi)參法2ΔΔCT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)處理?3?次重復(fù)。

1.2.4? 低溫處理后-1，3-葡聚糖酶活性的測(cè)定? 為進(jìn)一步探討不同溫度處理下三明野生蕉Mug?sp7?轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)模式，測(cè)定不同溫度處理下的β-1，3-葡聚糖酶活性。精確配制1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照表3的順序依次在編號(hào)1～6的試管中加入相應(yīng)試劑，充分混勻后沸水浴5 min，定容至25?mL。測(cè)定所有試管溶液的吸光度（A），使用的波長(zhǎng)為540?nm。制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。將生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)勢(shì)相近的三明野生蕉葉片分別經(jīng)過8?℃處理1、2、3、4、5?d后，參考蔣躍明[18]方法測(cè)定β-1，3-葡聚糖酶活性。每個(gè)處理?3?個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表3? 測(cè)定酶活性其試劑加入順序

Tab. 3? Enzyme activity assay reagent addition

試管編號(hào)Test tube number

1???? 2???? 3???? 4???? 5???? 6

含糖量/mg???? 0???? 0.4?? 0.8?? 1.2?? 1.6?? 2.0

葡萄糖/mL???? 0???? 0.4?? 0.8?? 1.2?? 1.6?? 2.0

蒸餾水/mL???? 2???? 1.6?? 1.2?? 0.8?? 0.4?? 0

DNS/mL 2???? 2???? 2???? 2???? 2???? 2

M：DL2000 Marker;泳道1和泳道2分別是

cDNA和gDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。

M： DL2000 marker. Lane 1 and lane 2 are amplified products of cDNA and gDNA， respectively.

圖1? PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig. 1? Electrophoresis of PCR amplification

2? 結(jié)果與分析

2.1? 三明野生蕉β-1，3-葡聚糖酶基因Mugsp7 cDNA與gDNA序列獲得

以三明野生蕉的cDNA和gDNA為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果見圖1。預(yù)測(cè)目的條帶約為1000?bp，第1條帶接近1000?bp，第2條帶接近1100?bp，與預(yù)測(cè)長(zhǎng)度相符且條帶明亮，因此，割下這2條帶放入1.5?mL的離心管進(jìn)行回收、純化、TA克隆和菌液PCR鑒定。菌液PCR產(chǎn)物，采用1%凝膠電泳檢測(cè)，挑選陽性克隆子送測(cè)。測(cè)序結(jié)果顯示，這2條序列均帶有完整的?ORF，最后獲得了984?bp的?ORF cDNA?序列，1132?bp?的gDNA序列。

在?NCBI?上進(jìn)行?BLAST?發(fā)現(xiàn)，目的條帶的序列與其他物種的-1，3-葡聚糖酶基因序列具有較高的相似性，且在NCBI上進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，所得的-1，3-葡聚糖酶基因序列具有糖基水解酶第17家族保守特征結(jié)構(gòu)域[LIVM]. [LIVMFYWA]{3} [STAG]E[STA]GWP[STN]. [SAGQ]。將克隆得到的開放閱讀框序列與模板基因（GSMUA_Ach?r?5?T??0?8??100_001）序列進(jìn)行比對(duì)，相似性達(dá)到97.67%，說明克隆獲得的序列為三明野生蕉的β-1，3-葡聚糖酶基因，命名為?Mugsp7，其cDNA、gDNA序列在NCBI上的登錄號(hào)分別為?KU?36?3?8?0?8、KU363809。同時(shí)將?cDNA、gDNA?序列在?DNA?M?AN6.0?軟件上比對(duì)發(fā)現(xiàn)，β-1，3-葡聚糖酶基因Mug?sp7具有一個(gè)148?bp的內(nèi)含子。

2.2? 三明野生蕉Mugsp7蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1? 蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)分析? 采用Pro?p?ram對(duì)Mugsp7蛋白基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明：Mugsp7基因共編碼327個(gè)氨基酸，編碼的蛋白分子量為?35154.8 Da，預(yù)測(cè)分子式為C1560H2433N443O463S11，理論P(yáng)I值為6.53。該蛋白屬于酸性、親水、穩(wěn)定性蛋白。該基因共編碼?20?種氨基酸，其中丙氨酸（Ala）的含量最高，為13.5%，其次是纈氨酸（Val），為9.5%。預(yù)計(jì)N端氨基酸為蛋氨酸（Met），該蛋白的脂肪族系數(shù)為85.08。使用SignalP 4.0 Server 軟件對(duì)Mugsp7蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，Mugsp7蛋白不具有典型的信號(hào)肽。使用PSORT對(duì)Mugsp7蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，Mugsp7蛋白位于葉綠體基質(zhì)、線粒體基質(zhì)空間、線粒體膜間隙、細(xì)胞質(zhì)的可能性分別為0.520、0518、0.473、0.450，主要定位在葉綠體基質(zhì)和線粒體基質(zhì)上。

2.2.2? 蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析? 使用TMpred對(duì)Mugsp7的蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Mugsp7屬于跨膜蛋白，跨膜區(qū)域共有8

個(gè)，即內(nèi)到外和外到內(nèi)的跨膜區(qū)域各有4個(gè)，7～25位氨基酸最有可能形成從內(nèi)到外的跨膜區(qū)域，161～188位氨基酸最有可能形成從外到內(nèi)的跨膜區(qū)域。使用NCBI-Protein Tools對(duì)Mugsp7蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Mugsp7蛋白屬于糖基水解酶第17家族（Glycosyl hydrolases family），該蛋白質(zhì)在第17～27?個(gè)氨基酸之間含有一大段與糖基水解酶第17家族一致的保守結(jié)構(gòu)域即，[LIVM]. [LIVMFYWA]{3}[STAG]E[STA]GWP[STN]. [SA?G?Q]。因此，Mugsp7蛋白屬于糖基水解酶第17家族，很有可能在糖基水解酶調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用。

2.2.3? Mugsp7蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析? 使用Coils預(yù)測(cè)Mugsp7蛋白的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，Mugsp7蛋白卷曲的幾率小于20%。根據(jù)?Coils?判斷方法，即若幾率小于50%螺旋結(jié)構(gòu)就不能形成，幾率大于50%則螺旋結(jié)構(gòu)有可能形成，故Mugsp7蛋白形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的可能性很小，因此，推測(cè)Mugsp7沒有卷曲螺旋的結(jié)構(gòu)。使用NPS預(yù)測(cè)Mugsp7蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，Mugsp7蛋白的結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲（41.28%）、α螺旋（30.28%）和延伸鏈（28.44%）組成。由于富含無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，能形成多種構(gòu)象，在不同條件下可表達(dá)不同的功能。使用Swiss-model預(yù)測(cè)三明野生蕉Mugsp7?蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)（圖3），其主要的結(jié)構(gòu)元件是無規(guī)則卷曲、α螺旋和延伸鏈，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果保持一致。使用NetPhos?2.0?對(duì)?Mugsp7?蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，Mugsp7?蛋白可能在絲氨酸（4個(gè)）、蘇氨酸（2個(gè)）和酪氨酸（2個(gè)）這?3?種氨基酸上發(fā)生磷酸化修飾。

2.2.4? Mugsp7氨基酸序列同源性和分子系統(tǒng)進(jìn)化分析? 使用NCBI對(duì)三明野生蕉Mugsp7蛋白和其他物種β-1，3-葡聚糖酶的同源性進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析。根據(jù)對(duì)比結(jié)果，選取有代表性的和同源性高的幾個(gè)物種建立發(fā)育樹，主要的分析結(jié)果為：三明野生蕉Mugsp7與水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea）的相似性均為59%，與大葉藻（Zostera marina）的相似性為58%，與大麥（Hordeum vulgare）的相似性為54%，與葡萄（Vitis vinifera）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）的相似性為49%。采用MEGA6.0對(duì)具有代表性的單子葉和雙子葉植物的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，擬南芥獨(dú)立分為一類（圖4）。葡萄、橡膠樹、田菁、油橄欖、玫瑰、百合和可可樹分為一類，三明野生蕉Mugsp7與小果野蕉、大葉藻、玉米、大麥、水稻分為一類，且與小果野蕉位于同一分支，說明三明野生蕉Mugsp7與小果野蕉具有高度的親緣關(guān)系。

2.3? 低溫下三明野生蕉Mugsp7的熒光定量表達(dá)分析

在不同溫度（28、20、13、8、4、0、?2、?4、和?6?℃） 處理36 h，以28 ℃處理為對(duì)照，Mugsp7的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)“升-降-升-降”趨勢(shì)（圖5）。當(dāng)溫度為13?℃時(shí)，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，約為對(duì)照組的6.5倍。當(dāng)溫度為8?℃時(shí)，Mugsp7的相對(duì)表達(dá)量突然降低，為對(duì)照組的0.57倍。在更低溫度下，表達(dá)量稍微上升后又下降。結(jié)果表明，除13?℃處理外，Mugsp7在其他溫度的表達(dá)水平均較低。由于13?℃是生長(zhǎng)臨界溫度，以上結(jié)果說

為進(jìn)一步了解三明野生蕉β-1，3-葡聚糖酶基因Mugsp7在8?℃低溫表達(dá)量突然下降的原因，對(duì)三明野生蕉組培苗在8?℃中進(jìn)行0～36 h的不同時(shí)間處理。以28?℃處理為對(duì)照，Mugsp7的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)“升-降-升”趨勢(shì)（圖6），表明Mugsp7可以快速響應(yīng)8?℃。而8?℃下不同持續(xù)時(shí)間處理會(huì)使表達(dá)量發(fā)生變化，且低溫不同持續(xù)時(shí)間處理的表達(dá)量均高于對(duì)照組，介于1.6和7倍之間。在8?℃低溫處理4 h時(shí)，Mugsp7的表達(dá)量達(dá)到最大值約為對(duì)照的7倍。處理8 h時(shí)，其表達(dá)量突然降低，約為對(duì)照的1.6倍，而后隨著低溫時(shí)間持續(xù)增加，Mugsp7的表達(dá)量變化不明顯。因此，研究結(jié)果表明，Mugsp7在低溫不同持續(xù)時(shí)間剛開始發(fā)生變化時(shí)即感受低溫，同時(shí)開始啟動(dòng)抗寒應(yīng)答。

2.4? 低溫處理后三明野生蕉β-1，3-葡聚糖酶活性變化

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式和相應(yīng)計(jì)算得到三明野生蕉β-1，3-葡聚糖酶活性（圖7）。結(jié)果顯示，將三明野生蕉葉片置于低溫下處理一定時(shí)間（8?℃處理1、2、3、4和5?d），葉片體內(nèi)的β-1，3-葡聚糖酶活性發(fā)生了顯著性變化，總體上呈現(xiàn)“先升后降”的趨勢(shì)，在正常植物體葉片中通常是低水平表達(dá)的[19]。在低溫處理的短時(shí)間內(nèi)即出現(xiàn)較大波動(dòng)，活性在第2天達(dá)到最高值。當(dāng)處理時(shí)間繼續(xù)增加，在第3天時(shí)突然下降，之后緩慢降低。因此，三明野生蕉β-1，3-葡聚糖酶在短時(shí)間低溫處理下對(duì)低溫的響應(yīng)強(qiáng)烈，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)低溫的響應(yīng)減弱。

A為還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，B為8?℃不同時(shí)間處理下β-1，3-葡聚糖酶活性的測(cè)定。*表示在0.05水平差異顯著，**表示在0.001

水平差異顯著。

通過?SPSS?軟件分析可知，8?℃下處理1、2、3?d與對(duì)照組間的酶活性具有極顯著差異，4、5?d與對(duì)照組的差異不明顯。表明低溫在一定時(shí)間內(nèi)會(huì)影響β-1，3-葡聚糖酶的活性，并且在處理2?d達(dá)到極大值。Mugsp7在8?℃下處理24～36?h期間基因表達(dá)顯著上調(diào)，與酶活性呈現(xiàn)一致的表達(dá)模式，而在處理3?d開始下降。處理1?d與處理3、4與5?d處理的酶活性無明顯差異，甚至低于對(duì)照組的活性。進(jìn)而推測(cè)β-1，3-葡聚糖酶可以協(xié)助三明野生蕉耐受一定時(shí)間的低溫，低溫處理2?d時(shí)，通過提高?Mugsp7?的表達(dá)量，提高酶活性，達(dá)到一定程度后（3?d），體內(nèi)抵抗低溫能力遭到破壞。

3? 討論

3.1? Mugsp7基因結(jié)構(gòu)可能與三明野生蕉抗寒功能相關(guān)

低溫處理下三明野生蕉Mugsp7蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲（41.28%）、α?螺旋（30.28%）、延伸鏈（28.44%）構(gòu)成。三明野生蕉β-1，3-葡聚糖酶?Mugsp7基因的表達(dá)情況賦予了植物一定的抗寒性，三明野生蕉的抗寒功能可能與這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)。正常生長(zhǎng)條件下，植物的細(xì)胞膜是流動(dòng)的。當(dāng)植物遭受低溫脅迫時(shí)，為維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育，可通過減少細(xì)胞膜的流動(dòng)性，增加其剛性，從而將減少低溫造成的傷害。

王維香等[20]認(rèn)為α螺旋可以與細(xì)胞膜結(jié)合，穩(wěn)定膜功能，防止膜低溫?fù)p傷，同時(shí)也可以抑制冰點(diǎn)的生長(zhǎng)。一般認(rèn)為，無規(guī)則卷曲區(qū)域可決定蛋白質(zhì)的功能，在不同條件下可表達(dá)不同的功能[21]。同時(shí)對(duì)最早在魚類中發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白基因研究發(fā)現(xiàn)，該基因在植物中表達(dá)可使植物降低胞外溶液冰點(diǎn)，從而使植物在抗寒性方面得到提高，并且該蛋白和其他一些抗凍蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中也含有該種結(jié)構(gòu)。其他已經(jīng)克隆獲得的β-1，3-葡聚糖酶成員中也含有這種結(jié)構(gòu)。因此，猜測(cè)這種二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于β-1，3-葡聚糖酶具有一定的抗寒性。通過進(jìn)化樹分析可知，不同物種的β-1，3-葡聚糖酶基因結(jié)構(gòu)的具有較高同源性，說明β-1，3-葡聚糖酶保守區(qū)域在遺傳過程中具有一定穩(wěn)定性。

3.2? Mugsp7抗寒作用機(jī)制的探討

β-1，3-葡聚糖酶基因是一類重要的抗逆境相關(guān)基因[22-23]。在本研究中，低溫8?℃不同時(shí)間處理后β-1，3-葡聚糖酶的活性呈現(xiàn)“先上升后下降”的趨勢(shì)，說明β-1，3-葡聚糖酶能夠響應(yīng)低溫脅迫。普遍認(rèn)為13?℃是香蕉的低溫臨界溫度[24]，在冷害溫度下，溫度越低則越快出現(xiàn)冷害[25]。本研究28～?6?℃的實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明，整體呈現(xiàn)出“先升高后降低”的表達(dá)趨勢(shì)，特別是在13?℃達(dá)到了極大值，可能原因是三明野生蕉Mugsp7對(duì)溫度敏感，提高表達(dá)量的同時(shí)累積了一定量的β-1，3-葡聚糖酶，足夠抵抗8?℃一定時(shí)間的低溫脅迫，所以8?℃條件下表達(dá)量急劇降低。這與張妙霞[4]推測(cè)三明野生蕉Mugsp基因的抗寒作用具有累積效應(yīng)一致，并得出Mugsp1基因是抗凍蛋白基因。本研究?Mugsp7?能強(qiáng)烈響應(yīng)低溫，特別是臨界生長(zhǎng)點(diǎn)13?℃，但在0?℃后，表達(dá)量很低甚至接近?0，可能不同物種、不同成員功能上有差異。將Mugsp7?低溫下的定量表達(dá)結(jié)果同陳芳蘭等[3]的Mugsp1.2-5?基因在低溫下的表達(dá)情況比較發(fā)現(xiàn)，β-1，3-葡聚糖酶基因不同成員都在8?℃下1～4?h顯著提高表達(dá)量，但是不同成員的表達(dá)模式不盡相同，不同的是在香蕉生長(zhǎng)臨界溫度（13?℃）下，Mugsp7基因達(dá)到表達(dá)高峰，這與陳芳蘭等[3]的結(jié)果有所差異。Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp5在4?℃時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，Mugsp1、Mugsp3、Mugsp4?在0?℃表達(dá)量達(dá)到最高。推測(cè)在低溫下，本研究克隆獲得的三明野生蕉β-1， 3-葡聚糖酶基因Mug?sp7，協(xié)同和互補(bǔ)了陳芳蘭等[3]及張妙霞[4]克隆獲得的Mugsp、Mugsp1-5基因等β-1， 3-葡聚糖酶家族基因，幫助植物抵抗低溫脅迫，家族基因間的協(xié)同表達(dá)作用提高了β-1， 3-葡聚糖酶抗寒效應(yīng)。然而，β-1， 3-葡聚糖酶基因在感受到低溫信號(hào)后具體是如何傳遞的、如何提高植物抗寒等問題可以在今后中進(jìn)行深入的研究。

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