白細(xì)胞介素-1β siRNA聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療效果的研究

周天勝，董軒，潘士鋒，劉宗平*，邢華*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；3. 蘇州藥明康德新藥開發(fā)有限公司，江蘇 蘇州 215104；4. 上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司，上海 200131)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病[1]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)也給社會(huì)帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)，然而目前在臨床上仍缺少對(duì)這種慢性炎癥性疾病的根治性療法。以往研究表明，抑制白細(xì)胞介素1β的表達(dá)，可明顯改善大鼠RA臨床癥狀[2]，因此，IL-1β有可能成為治療RA的潛在靶點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)生物學(xué)特性獨(dú)特，可參與多環(huán)節(jié)的免疫調(diào)節(jié)，具有促進(jìn)組織損傷修復(fù)的作用[3-4]，因而被廣泛應(yīng)用于免疫性疾病的細(xì)胞治療。本試驗(yàn)利用Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)方法制備RA大鼠模型，初步探討IL-1β在RA等自身免疫病發(fā)病機(jī)制中的作用。然后對(duì)模型大鼠分別進(jìn)行PBS，IL-1β-siRNA以及IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs協(xié)同治療，檢測(cè)大鼠形態(tài)學(xué)、行為學(xué)、組織病理學(xué)和免疫學(xué)等變化情況，綜合分析治療效果，為基因聯(lián)合細(xì)胞治療RA開辟了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雌性Wistar大鼠(8-10周齡，200-250 g)由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(蘇)2017-0044。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠飼喂標(biāo)準(zhǔn)化商品鼠糧，飼養(yǎng)在常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境，溫度：(24±2)℃，濕度：(60±10)%。

1.1.2 主要試劑

雞Ⅱ型膠原蛋白、弗氏完全佐劑、DEPC、戊巴比妥鈉，來(lái)自Sigma公司；TRIZOL來(lái)自Invitrogen；EntransterTM-in vivo和siRNA來(lái)自Engreen Biosystem公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix ExTaqTM Ⅱ、大鼠IL-1β ELISA Kit，均購(gòu)買于TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠關(guān)節(jié)炎模型的建立

將40只大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組(n=10)和Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)模型組(n=30)。初次免疫時(shí)，CIA模型組用含有雞Ⅱ型膠原蛋白的乳化液1 mL背部皮內(nèi)分點(diǎn)注射，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。初次免疫7 d后加強(qiáng)免疫一次，CIA模型組腹腔注射含有雞Ⅱ型膠原蛋白的乳化液0.5 mL，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。免疫后，每周測(cè)定一次動(dòng)物體重以及足趾腫脹值。

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè)

采用強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)檢測(cè)治療前后大鼠的行為學(xué)變化。強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)前將大鼠放入實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)30 min，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的時(shí)間為白天3 h，夜間2 h。實(shí)驗(yàn)前1 d，訓(xùn)練大鼠，將其放入透明有機(jī)玻璃缸中-缸周圍用黑色有機(jī)玻璃隔離。大鼠在缸中游泳15 min，使其適應(yīng)游泳環(huán)境；試驗(yàn)時(shí)對(duì)大鼠在缸中游泳情況進(jìn)行連續(xù)攝像6 min。試驗(yàn)結(jié)束后觀察并記錄大鼠的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間(大鼠在水中停止掙扎呈漂浮狀態(tài)，或者僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部在水面下)和掙扎時(shí)間。

1.2.3 血清IL-1β濃度的檢測(cè)

分別于造模后和治療后第2周和第4周從眼眶后靜脈叢取血，并制備血清，使用ELISA試劑盒檢測(cè)血清IL-1β水平。

1.2.4 Foxp3和TGF-β1 mRNA表達(dá)的檢測(cè)

分別采集正常組和CIA模型組動(dòng)物的脾臟組織，使用Trizol總RNA提取試劑盒提取總RNA，使用TaRaKa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR檢測(cè)TGF-β1和Foxp3的mRNA表達(dá)，TGF-β1上游引物為5′-TGCTGCCGCTTCTGCTCCCACTC-3′，下游引物為5′-ATAGATTGCGTTGTTGCGGTCCAC-3′；Foxp3上游引物5′-GCTTGTTTGCTGTGCGGAGAC-3′，下游引物5′-ATAGATTGCGTTGTTGCGGTCCAC-3′；以β-actin作為內(nèi)參。移植治療2周和4周后對(duì)脾臟組織中Foxp3和TGF-β1表達(dá)檢測(cè)，步驟同上。

1.2.5 關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)檢查

建模4周后，采集大鼠膝關(guān)節(jié)，固定于10%中性福爾馬林溶液中，經(jīng)脫鈣、取材、脫水、包埋、切片、HE染色和鏡檢。

1.2.6 IL-1β-siRNA及IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs協(xié)同治療RA效果

采集大鼠股骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，貼壁增殖培養(yǎng)3代用于后續(xù)細(xì)胞移植治療試驗(yàn)。成功CIA模型大鼠被隨機(jī)分為PBS治療組、IL-1β-siRNA治療組、IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組3組，分別進(jìn)行尾靜脈注射等量PBS、IL-1β siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合液(用5%葡萄糖配制2.5 mg/kg的IL-1β-siRNA(由Invitrogen公司提供)，與等體積的轉(zhuǎn)染試劑混合，靜置15 min用于尾靜脈注射)以及IL-1β-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑混合液(同IL-1β-siRNA治療組)和BMSCs，BMSCs的注射濃度為1×107個(gè)/kg大鼠體重。每組的給藥頻率為每周一次。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±SE)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立

造模期間動(dòng)物無(wú)死亡，正常對(duì)照組大鼠隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體重逐漸增加，精神狀態(tài)良好。CIA模型組大鼠在首次免疫后第1周開始，體重增長(zhǎng)緩慢，在造模1-4周內(nèi)，模型組體重增長(zhǎng)均顯著小于對(duì)照組大鼠(圖1A)。

此外，對(duì)照組大鼠足趾均未見腫脹，而CIA模型組大鼠在初次免疫后第1周部分大鼠足趾表面發(fā)紅，第2周開始出現(xiàn)后足爪明顯腫脹，關(guān)節(jié)僵硬，活動(dòng)受限，足趾腫脹在第3周達(dá)到病程的最高峰，之后趨于穩(wěn)定，持續(xù)至第4周(圖1B)。關(guān)節(jié)腫脹度提示CIA模型大鼠關(guān)節(jié)病變從第1周開始，持續(xù)至第4周，且第2至第3周關(guān)節(jié)病變最明顯。

A.大鼠體重；B.足趾腫脹值；C.不動(dòng)時(shí)間；D.掙扎時(shí)間；E.血清中IL-1β濃度；F.脾臟中TGF-β1和Foxp3mRNA相對(duì)表達(dá)量

對(duì)建模前后大鼠每周進(jìn)行一次強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)，并進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組大鼠相比，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，CIA模型組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間(圖1C)隨病程發(fā)展越來(lái)越長(zhǎng)，而大鼠強(qiáng)迫游泳的掙扎時(shí)間(圖1D)逐漸減少，說(shuō)明建模后模型大鼠后肢運(yùn)動(dòng)障礙嚴(yán)重。建模后每?jī)芍軝z測(cè)血清中IL-1β濃度，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清中IL-1β水平隨著病程的發(fā)展逐漸上升，2周和4周時(shí)均極顯著高于正常對(duì)照組大鼠(圖1E)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，造模4周后，與正常對(duì)照組大鼠相比，CIA模型大鼠脾臟組織中TGF-β1以及Foxp3 mRNA表達(dá)量均極顯著低于對(duì)照組(圖1F)。

2.2 關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)變化

造模4周后對(duì)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，鏡檢發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑、滑膜組織細(xì)胞排列整齊規(guī)則(圖2A)，而CIA模型大鼠呈現(xiàn)典型的關(guān)節(jié)炎癥狀，關(guān)節(jié)軟骨有明顯的糜爛或潰瘍，滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)腔內(nèi)有重度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，包括中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，伴有輕微出血和纖維素性滲出(圖2B)。

A.正常大鼠關(guān)節(jié)；B.CIA模型大呈現(xiàn)重度的關(guān)節(jié)炎(箭頭所示炎性細(xì)胞浸潤(rùn))

圖2 關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化

2.3 IL-1β-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染聯(lián)合BMSCs協(xié)同治療RA的效果

與PBS假治療組大鼠相比，IL-1β-siRNA治療組和IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠體重增長(zhǎng)均極顯著升高，IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠體重增長(zhǎng)更加明顯(圖3A)；此外，IL-1β-siRNA治療組和IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠足趾腫脹值均顯著降低，且IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠足趾腫脹值降低的更加明顯(圖3B)。

在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中，IL-1β-siRNA治療組和IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠不動(dòng)時(shí)間均極顯著低于PBS對(duì)照組，且在治療1周和2周后IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠不動(dòng)時(shí)間極顯著低于IL-1β-siRNA單獨(dú)治療組(圖3C)；大鼠強(qiáng)迫游泳的掙扎時(shí)間在治療后均極顯著高于PBS對(duì)照組，治療后1、2、3周IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠掙扎時(shí)間極顯著高于IL-1β-siRNA單獨(dú)治療組(圖3D)；治療2周和4周后，治療組大鼠血清中IL-1β的表達(dá)量均極顯著低于PBS對(duì)照組，且IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠血清中IL-1β水平極顯著低于IL-1β-siRNA單獨(dú)治療組(圖3E)；此外，大鼠脾臟組織中TGF-β1和Foxp3的mRNA相對(duì)表達(dá)量在治療組均極顯著升高，且IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠脾臟組織中TGF-β1和Foxp3的mRNA表達(dá)極顯著高于IL-1β-siRNA治療組(圖3F)。

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，被認(rèn)為是危害人類健康的五大疾病之一，病因尚未明確。動(dòng)物模型在研究RA發(fā)病機(jī)制中起著非常重要的作用。目前用于制備RA模型的方法和試劑有很多[5-8]，其中Trentham等于1977年首次建立了Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。在前人研究的基礎(chǔ)上，在本研究對(duì)CIA造模方法進(jìn)行了改良，選取了Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑的聯(lián)合乳化液以及重復(fù)注射一次混合抗原，在保證了模型成功率(80%)的同時(shí)也使得模型的病理變化及免疫學(xué)特性更加穩(wěn)定、與人類RA更為相似，為后續(xù)深入研究RA治療方法提供了更加理想的動(dòng)物模型。

RA關(guān)節(jié)損傷相關(guān)的最重要的細(xì)胞因子就是IL-1，它可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的大量聚集，提高中性粒細(xì)胞對(duì)前列腺素的分泌，從而增加滑膜細(xì)胞膠原酶、軟骨細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的表達(dá)量，蛋白激酶分泌增加導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生[9]。在眾多細(xì)胞因子中IL-1β在RA的發(fā)病中起著重要的作用，它在滑膜炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的循環(huán)網(wǎng)絡(luò)中起著調(diào)控作用，可以作為判斷RA病情的嚴(yán)重程度以及評(píng)價(jià)RA臨床療效的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠呈現(xiàn)典型的關(guān)節(jié)炎癥狀，且血清中IL-1β含量極顯著升高，結(jié)合行為學(xué)、組織病理學(xué)和免疫學(xué)的變化情況，提示RA模型制備成功，并且IL-1β可能在RA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，很可能作為治療RA的重要靶點(diǎn)。說(shuō)明可通過(guò)對(duì)IL-1β進(jìn)行阻斷，降低動(dòng)物機(jī)體IL-1β的水平，從而阻止滑膜炎的產(chǎn)生、發(fā)展，從而對(duì)RA的治療起到積極作用。

A.體重增長(zhǎng)；B.足趾腫脹值；C.不動(dòng)時(shí)間；D.掙扎時(shí)間；E.血清中IL-1β濃度；F.脾臟中TGF-β1以及Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖3 治療后各組大鼠試驗(yàn)項(xiàng)目

siRNA是目前一種有效的用于沉默基因表達(dá)的技術(shù)，并且siRNA的療法在減少實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎炎癥方面已被證實(shí)很有前景[10-14]。BMSCs作為一種基質(zhì)干細(xì)胞，它能夠促進(jìn)多種組織的修復(fù)和再生[15]，在一定的誘導(dǎo)條件下BMSCs不僅能多向分化為多種組織細(xì)胞，還能通過(guò)分泌多種基質(zhì)分子來(lái)促進(jìn)損傷組織的修復(fù)[15-18]。本試驗(yàn)選用干擾siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法來(lái)治療RA模型大鼠，并基于BMSCs的獨(dú)特優(yōu)越性，使用干擾siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)合BMSCs移植來(lái)治療RA模型大鼠，以期得到更優(yōu)的治療效果。比較各組治療效果，發(fā)現(xiàn)IL-1β-siRNA治療組和IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組在形態(tài)學(xué)、行為學(xué)、組織病理學(xué)以及免疫學(xué)水平對(duì)RA模型大鼠都具有較好的治療效果，且IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組對(duì)RA模型大鼠的癥狀緩解具有更顯著的效果，說(shuō)明IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs可以增強(qiáng)RA的治療效果。

轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在CD4+CD25+Treg上特異性大量表達(dá)，對(duì)其功能的發(fā)揮和發(fā)育中都起著非常重要的作用[19-20]。CD4+CD25+T細(xì)胞如果缺失了Foxp3的表達(dá)，就行使不了細(xì)胞功能。自從發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上特異性大量分泌Foxp3以來(lái)，已有多項(xiàng)研究證明在Treg上Foxp3的表達(dá)量變化直接顯現(xiàn)CD4+CD25+T細(xì)胞水平的功能活性和變化[21-22]。表達(dá)于細(xì)胞表面或者分泌至細(xì)胞外的TGF-β1是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)制之一[23]。TGF-β1是一種主要介導(dǎo)細(xì)胞接觸免疫并且對(duì)細(xì)胞分化具有雙重調(diào)節(jié)作用的多肽因子，它可以增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)合成以及炎癥細(xì)胞趨化，抑制免疫反應(yīng)等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIA模型大鼠脾臟組織中TGF-β1的mRNA表達(dá)量極顯著低于正常對(duì)照組大鼠，提示模型大鼠體內(nèi)TGF-β1分泌減少可能不足以抑制自身免疫炎癥的發(fā)展，這可能也是實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要原因之一。在Ⅱ型膠原的刺激下，T淋巴細(xì)胞過(guò)度增生、活化，可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的減少或者功能缺失有關(guān)，模型大鼠脾臟中Foxp3mRNA表達(dá)顯著下降，F(xiàn)oxp3mRNA的下調(diào)也促使CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)TGF-β1分泌降低。而在治療實(shí)驗(yàn)中，IL-1β-siRNA治療組以及IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs治療組大鼠脾臟組織中TGF-β1和Foxp3mRNA表達(dá)量均顯著上調(diào)，表明RA機(jī)體CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量和功能都有所改善，說(shuō)明了RA關(guān)節(jié)炎癥狀的改善可能與Treg功能和數(shù)量的改變有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明，Ⅱ型膠原可成功誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎模型，IL-1β可能在RA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs可以增強(qiáng)RA的治療效果，從而為基因聯(lián)合細(xì)胞治療RA提供了理論基礎(chǔ)。