利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建TiKi1和TiKi2雙基因敲除兔

吳彩霞，劉朝明*，顏泉梅，張全軍，歐陽(yáng)振，趙宇，樊娜娜，賴良學(xué)，2*

(1. 中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東 廣州 510530；2. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

動(dòng)物模型是科學(xué)研究不可缺少的工具，受到取材和倫理道德的限制，很多研究無(wú)法直接在人體中進(jìn)行，必須首先依靠動(dòng)物模型進(jìn)行廣泛的試驗(yàn)和評(píng)估。小鼠等嚙齒類作為經(jīng)典的模式動(dòng)物，在行為學(xué)研究方面都已非常深入，但由于其本身存在著難以克服的缺陷使其越來(lái)越難以滿足科研需求。一些致病突變?cè)谛∈笊弦鸬陌Y狀與在人類自身引起的癥狀明顯不同甚至截然相反，這讓小鼠等嚙齒類動(dòng)物模型無(wú)法滿足人類疾病相關(guān)的研究[1]。家兔生理結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)發(fā)育也比嚙齒類動(dòng)物更接近于人類，尤其是比小鼠等能更真實(shí)地模擬人類疾病的發(fā)病機(jī)制，目前已經(jīng)成為多種人類疾病模型和發(fā)育機(jī)制研究模型的首選[2]。兔作為極具利用價(jià)值的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，與其自身特有的生物學(xué)特點(diǎn)及發(fā)育特點(diǎn)密切相關(guān)。兔性成熟早、妊娠期短、窩產(chǎn)仔數(shù)多、個(gè)體差異小等特點(diǎn)[3]。和其它動(dòng)物(小鼠、豚鼠、豬等)相比，兔體型適中，價(jià)格低、飼養(yǎng)管理成本低，適合科研機(jī)構(gòu)在有限的空間內(nèi)飼養(yǎng)、繁殖、操作、觀察[4]。哺乳動(dòng)物基因靶向修飾技術(shù)以前主要是利用DNA同源重組的原理將外源基因定點(diǎn)插入目的基因，使目的基因敲除或修飾，再利用胚胎干細(xì)胞囊胚顯微注射技術(shù)或體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得基因打靶動(dòng)物模型[5]。但對(duì)于尚未建立胚胎干細(xì)胞的動(dòng)物來(lái)說(shuō)，只能在體細(xì)胞上利用同源重組技術(shù)獲得目的基因修飾的陽(yáng)性細(xì)胞，再經(jīng)過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得基因修飾動(dòng)物[6]。但是對(duì)于家兔這種既沒(méi)有建立能夠生殖系遺傳的胚胎干細(xì)胞，克隆效率又極低的物種來(lái)說(shuō)，獲得期望的基因打靶動(dòng)物曾經(jīng)是極其困難的[7]。體細(xì)胞基因靶向修飾的低效率極大地限制了基因修飾大動(dòng)物的應(yīng)用與發(fā)展，然而，鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)以及成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)核酸酶9(clustered regularly interspaced palindromic repeat/CRISPR associated RAN-guided endonuclease 9,CRISPR/Cas9)技術(shù)的出現(xiàn)極大地促進(jìn)了基因靶向修飾動(dòng)物的研究，為這些克隆效率低下又缺少全能性胚胎干細(xì)胞物種的基因修飾開(kāi)辟了新渠道。

Tiki基因是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)基因，在Wnt信號(hào)通路中作為抑制因子而發(fā)揮作用，在爪蟾上研究結(jié)果表明，缺失TiKi基因會(huì)導(dǎo)致爪蟾頭部的缺失[8]。由于TiKi基因包含TiKi2和TiKi1兩種類型，因此建立一種同時(shí)敲除TiKi2和TiKi1兩種基因的兔模型，能更好地研究TiKi基因是否影響兔頭部的早期發(fā)育。但ZFN制備復(fù)雜、打靶效率低、成本高昂限制了其在基因修飾兔研究中的應(yīng)用。TALENs的打靶效率也尚不夠高，生出來(lái)的動(dòng)物大多都是TiKi1或TiKi2單等位基因敲除動(dòng)物模型，難以直接獲得TiKi1或TiKi2雙等位基因敲除動(dòng)物模型，要想獲得TiKi1和TiKi2同時(shí)雙等位基因敲除動(dòng)物模型更加困難，不利于全面研究TiKi對(duì)哺乳動(dòng)物頭部早期發(fā)育的影響。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷發(fā)展，單基因乃至多基因修飾兔將逐步發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，為人類疾病、藥物開(kāi)發(fā)、發(fā)育機(jī)制等研究提供更加真實(shí)、可靠、有效的動(dòng)物模型。本研究致力于建立家兔CRISPR/Cas9高效的雙基因修飾技術(shù)體系，該技術(shù)平臺(tái)的成功構(gòu)建，將為日后獲得其他雙基因修飾兔模型以及對(duì)兔自身基因的深入研究提供技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

分子實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)自TaKaRa 公司，細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑無(wú)特殊說(shuō)明均為 Gibco，化學(xué)試劑無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)自Sigma 公司。兔子為新西蘭白兔，普通級(jí)，雌性6～8月齡，體重2～4.5 kg，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證為[SCXK 粵 2011—0015]。飼養(yǎng)條件：室溫18～25 ℃、濕度 40%～70%、換氣良好、12/12 h光照條件，自由飲水，每只每次添加80 g顆粒飼料，每天2次，并輔助飼喂胡蘿卜、青菜等青綠飼料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 TIKI基因靶位點(diǎn)的選擇及gRNA的制作

靶位點(diǎn)的選擇：基因靶位點(diǎn)的選擇遵循GGN(17-18)NGG(N為任意堿基)的序列要求，其中GGN(17-18)是與靶基因結(jié)合的位點(diǎn)， NGG是Cas9蛋白切割所必須的PAM區(qū)。由于本試驗(yàn)所用的pT7-gRNA 體外轉(zhuǎn)錄載體是T7啟動(dòng)子，故要求第二位堿基也為G；若是選擇別的啟動(dòng)子則第二位堿基可任意修改。此外，可在正義鏈或反義鏈上選擇靶位點(diǎn)。

L-gRNA與退火靶位點(diǎn)的連接：L-gRNA與退火靶位點(diǎn)的連接用TaKaRa公司提供的 solutionⅠ，在 PCR 管中配置反應(yīng)液混勻后，16 ℃，30 min。然后轉(zhuǎn)化，涂氨芐抗性的平板，第二天后挑取4個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序引物用通用引物 M13-47，測(cè)序正確的gRNA質(zhì)粒備用。具體步驟如下： 10 μL 連接產(chǎn)物+50 μL Top 10感受態(tài)細(xì)胞→混勻后，冰上放置30 min→42 ℃，90 s→冰上冷卻約3 min→加入 500 μL 無(wú)抗性LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床中搖晃 30 min→取250μL涂氨芐平板，過(guò)夜培養(yǎng)→挑取單個(gè)菌落。

1.2.2 gRNA和Cas9的體外轉(zhuǎn)錄

靶位點(diǎn)gRNA的體外轉(zhuǎn)錄模板的制備：用引物 T7-s(5′-GAAATTAATACGACTCACTATA-3′)和tracr-rev(5′-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3′)，以測(cè)序正確的gRNA質(zhì)粒作為模板，用高保真酶PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(TaKaRa)擴(kuò)增用來(lái)體外轉(zhuǎn)錄gRNA的模板。

gRNA的體外轉(zhuǎn)錄：用 T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit( NEB)體外轉(zhuǎn)錄gRNA。用該試劑盒自帶的Licl回收純化體外轉(zhuǎn)錄的gRNA，-80 ℃保存作受精卵注射用。

Cas9質(zhì)粒的線性化及體外轉(zhuǎn)錄：Cas9質(zhì)粒(MLM3613)在體外轉(zhuǎn)錄成mRNA之前先用PmeⅠ內(nèi)切酶(NEB)線性化。跑膠檢測(cè)Cas9質(zhì)粒是否切割完全，切割完全則直接回收線性化的Cas9，測(cè)定濃度后用作體外轉(zhuǎn)錄mRNA模板，用mMESSAGE mMACHINE?T7 Kit 體外轉(zhuǎn)錄帶帽的cas9 RNA，按照回收gRNA的方法回收帶帽的體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 RNA,用E.coliPoly(A) Polymerase(NEB)對(duì)回收的帶帽的Cas9 RNA進(jìn)行加polyA反應(yīng)，這樣得到的Cas9 mRNA比較穩(wěn)定而且翻譯效率也更高。按照回收gRNA的方法回收 Cas9 mRNA，-80 ℃保存作受精卵注射用。

1.2.3 兔受精卵的顯微注射

母兔的超排和受精卵的收集：對(duì)發(fā)情期的供體母兔進(jìn)行肌肉注射100 IU的PMSG，注射后72～120 h和公兔合籠配種，取出卵巢和輸卵管置于預(yù)熱的1×PBS中，然后用沖卵液從輸卵管沖出受精卵，挑選原核期前后的受精卵置于胚胎培養(yǎng)液中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育待用。

受精卵的RNA顯微注射：把約30個(gè)原核期的受精卵放置在60 mm培養(yǎng)板的一個(gè)操作液滴中，用移液槍將約1 μL的Cas9 mRN和gRNA 混合液沿注射針玻璃管內(nèi)壁注射到底部，調(diào)節(jié)注射針和固定針的位置，使用固定管吸住受精卵，將注射針刺入受精卵的胞質(zhì)內(nèi)，注入約5～10 pl RNA，固定針去吸附下一個(gè)受精卵，進(jìn)行下一個(gè)受精卵的注射。

1.2.4 胚胎移植

將受體兔側(cè)臥固定在手術(shù)臺(tái)上，選擇距脊柱約5 cm，距肋弓后緣3 cm的視野，依次剪開(kāi)皮膚，肌肉層，腹膜后，小心牽扯出輸卵管和卵巢，觀察卵巢是否有排卵點(diǎn)，同時(shí)，讓助手把胚胎裝到胚胎移植管中，然后用鑷子輕輕捏住輸卵管傘部，助手用鑷子撥動(dòng)輸卵管使其拉直方便操作者將移植管從輸卵管傘口插入，深入至3 cm左右(壺腹部)后再后退一點(diǎn)，輕輕推入除1 cm長(zhǎng)的操作液外的所有液體到輸卵管中，撤出移植管。

1.2.5 分娩與護(hù)理

胚胎移植15 d左右，可以通過(guò)觸摸法來(lái)判斷受體母兔是否懷孕。適當(dāng)增加受孕兔的飼料和胡蘿卜的飼喂量，以保證胎兒的營(yíng)養(yǎng)需求。仔兔前12天左右單獨(dú)放到保溫的產(chǎn)箱內(nèi)，不和母兔放一起，每天飼喂2次。

1.2.6 體外注射受精胚胎及出生仔兔基因打靶的鑒定

注射后4 d左右，受精卵發(fā)育至囊胚階段，取出發(fā)育至囊胚階段的胚胎用1×PBS 清洗3遍，然后每個(gè)囊胚放入到一個(gè)PCR管中。每個(gè)囊胚用5～7 μL的NP40裂解液在PCR儀中進(jìn)行裂解，裂解好的囊胚-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ缓筮M(jìn)行PCR或者巢式PCR來(lái)擴(kuò)增目的片段進(jìn)行測(cè)序來(lái)鑒定各基因是否打靶。取3 μL PCR產(chǎn)物跑膠，確定大致濃度是否可以用來(lái)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示有兩套或兩套以上的峰圖的產(chǎn)物克隆到T載體上，以確定最終的基因突變情況。取新生仔兔的耳朵組織用天根血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒提取基因組，進(jìn)行PCR及測(cè)序來(lái)鑒定是否打靶。

2 結(jié)果與分析

2.1 TiKi1和TiKi2同時(shí)敲除靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)家兔的Tiki1和TiKi2基因的mRNA都是由賀熹教授實(shí)驗(yàn)室提供的?？紤]到TiKi1和TiKi2的同源性比較高，可能相互之間存在補(bǔ)償效應(yīng)，于是設(shè)計(jì)一個(gè)gRNA同時(shí)靶向TiKi1和TiKi2。

靶位點(diǎn)：CCCCTACACCATCTCGGCCC。該位點(diǎn)位于TiKi1基因外顯子2上，位于TiKi2基因外顯子2上。

2.2 家兔受精卵TiKi1和TiKi2基因打靶的結(jié)果及體外發(fā)育情況

2.2.1 注射后胚胎的體外發(fā)育結(jié)果

以200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA的濃度注射處于原核期的家兔受精卵的胞質(zhì)內(nèi)，注射的胚胎在胚胎培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚期(4d左右)，來(lái)檢測(cè)注射的RNA對(duì)胚胎發(fā)育是否存在影響。當(dāng)注射200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA時(shí)，共注射12個(gè)原核期的受精卵，其中有9個(gè)發(fā)育到囊胚期，囊胚率為75%(表1)。

表1 Cas9 mRNA和gRNA注射后胚胎的體外發(fā)育結(jié)果

靶基因濃度 (gRNA/cas9)注射胚胎數(shù)囊胚率/%TiKi1和TiKi220/200(ng/μL)129/12(75)

2.2.2 注射后家兔受精卵Tiki1和Tiki2基因打靶效率檢測(cè)

以200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL gRNA的濃度注射處于原核期的家兔受精卵的胞質(zhì)內(nèi)，注射的胚胎在胚胎培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚期(4 d左右)，來(lái)檢測(cè)注射的RNA是否具有對(duì)家兔相應(yīng)的靶位點(diǎn)進(jìn)行切割的作用，并統(tǒng)計(jì)其打靶效率。當(dāng)注射200 ng/μL Cas9 mRNA和20 ng/μL Tiki1+Tiki2gRNA時(shí)，注射12個(gè)原核期的受精卵，囊賠率為75%。對(duì)這些發(fā)育正常的囊胚進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序基因打靶效率檢測(cè)，若測(cè)序結(jié)果只有一套峰圖(圖1A)，則直接與WT序列進(jìn)行比對(duì)；若測(cè)序結(jié)果在靶位點(diǎn)附近存在兩套及兩套以上的峰圖(圖1B)，則回收該P(yáng)CR產(chǎn)物并與T載體連接，然后挑選單克隆進(jìn)行測(cè)序。在這9個(gè)囊胚中，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序發(fā)現(xiàn)9個(gè)囊胚(100%)都發(fā)生了Tiki1基因打靶，其中在5個(gè)(56%)囊胚中檢測(cè)到WT的序列，定義為Tiki1單等位基因敲除；剩下的4個(gè)(44%)沒(méi)有檢測(cè)到WT的序列是屬于Tiki1雙等位基因敲除(見(jiàn)表2)；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序發(fā)現(xiàn)9個(gè)囊胚(100%)都發(fā)生了Tiki2基因打靶，其中在6個(gè)(67%)囊胚中檢測(cè)到WT的序列，我們定義為Tiki2單等位基因敲除；剩下的3個(gè)(33%)沒(méi)有檢測(cè)到WT的序列是屬于Tiki2雙等位基因敲除(見(jiàn)表2)。

A. 測(cè)序峰圖在靶位點(diǎn)附近為一套峰圖；B. 測(cè)序峰圖在靶位點(diǎn)附近為2套或2套以上峰圖

圖1 測(cè)序峰圖表2 注射后家兔受精卵Tiki1和Tiki2基因修飾結(jié)果

靶基因濃度(gRNA/cas9)囊胚數(shù)基因修飾效率(%)雙等位基因敲除率(%)Tiki120/200(ng/μL)99/9(100)4/9(44)Tiki220/200(ng/μL)99/9(100)3/9(33)

2.3 TiKi1和TiKi2同時(shí)敲除打靶載體注射胚胎移植受體懷孕和仔兔出生結(jié)果

總共移植了51枚注射胚胎到6只受體母兔中，其中有1只受體母兔沒(méi)有檢測(cè)到懷孕，剩下的5只母兔先后產(chǎn)下共12只仔兔(表3)。經(jīng)測(cè)序鑒定其中有1只仔兔為TiKi1和TiKi2雙等位基因敲除模型。

表3 移植入受體兔的胚胎數(shù)量和仔兔出生結(jié)果

受體胚胎移植數(shù)新生仔兔數(shù)182293370492593692總數(shù)5112

2.4 TiKi1和TiKi2同時(shí)敲除打靶載體注射新生仔兔Tiki1基因突變結(jié)果

對(duì)測(cè)序結(jié)果在靶位點(diǎn)附近存在兩套及兩套以上峰圖的仔兔的PCR 產(chǎn)物，回收并與T載體連接，然后挑選單克隆進(jìn)行測(cè)序，再與WT序列比對(duì)，突變范圍從插入136 bp到缺失217 bp不等(圖2)。

2.5 TiKi1和TiKi2同時(shí)敲除打靶載體注射新生仔兔Tiki2基因突變結(jié)果

對(duì)測(cè)序結(jié)果在靶位點(diǎn)附近存在兩套及兩套以上峰圖的仔兔的PCR 產(chǎn)物，回收并與T載體連接，然后挑選單克隆進(jìn)行測(cè)序，再與WT序列比對(duì)，突變范圍從插入21 bp到缺失209 bp不等(圖3)。

注：短橫線表示的是缺失的堿基，下劃線表示的是靶位點(diǎn)

注：短橫線表示的是缺失的堿基，下劃線表示的是靶位點(diǎn)

圖3 新生仔兔Tiki2基因突變結(jié)果

3 討論

Wnt信號(hào)決定細(xì)胞的極性、命運(yùn)、前體細(xì)胞的增殖、體軸的建立，以及細(xì)胞的不對(duì)稱分裂等[8]。Wnt通路的失調(diào)引發(fā)多種癌癥，體軸發(fā)育不全等[9]。Tiki基因作為Wnt信號(hào)通路中的新的抑制因子進(jìn)入人們的視野，蛙的Tiki1不同時(shí)期的全胚胎原位雜交的結(jié)果顯示，從原條期到神經(jīng)溝時(shí)期，Tiki1的表達(dá)區(qū)域位于胚胎體軸的前端；小鼠的Tiki2不同時(shí)期全胚胎原位雜交結(jié)果表明，Tiki2最先在神經(jīng)褶階段表達(dá)，晚些時(shí)候在心臟原基階段表達(dá)[10]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)12-15 d，即原條期到神經(jīng)溝階段的豬胚胎進(jìn)行了全胚胎原位雜交，試驗(yàn)結(jié)果也顯示Tiki1基因在胚胎前端邊緣處表達(dá)，說(shuō)明在豬的胚胎發(fā)育過(guò)程中Tiki1極有可能像在蛙上一樣，對(duì)頭部的誘導(dǎo)起著關(guān)鍵性的作用。在豬胚胎上進(jìn)行的Tiki2基因的原位雜交結(jié)果和Tiki2在鼠胚胎上的原位雜交結(jié)果是一致的，均為沿著胚胎的中軸線縱向分布，且信號(hào)不強(qiáng)，貌似在胚胎中的表達(dá)豐度也不及Tiki1基因[11]。Tiki1和Tiki2是旁向性同源基因，其編碼的蛋白質(zhì)具有65%的同源性，且在抑制Wnt3a信號(hào)通路的過(guò)程中有著相似的功能?；赥iki基因的特殊性，即Tiki1基因在嚙齒類動(dòng)物，如小鼠、大鼠體內(nèi)缺失，使用小鼠作為研究人類Tiki1基因缺失的疾病模型這一傳統(tǒng)途徑被阻斷，而兔由于心血管系統(tǒng)與人類非常相似，成為研究Tiki基因極佳的哺乳動(dòng)物的選擇。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自1980年誕生后，經(jīng)過(guò)三十多年的迅速發(fā)展現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及生物學(xué)研究領(lǐng)域。目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)物存在的突出問(wèn)題是外源基因插入位點(diǎn)以及拷貝數(shù)的不可控性，導(dǎo)致了外源基因在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體之間表型不均一，從而嚴(yán)重制約了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的培育與應(yīng)用，只有對(duì)動(dòng)物基因組進(jìn)行定點(diǎn)的靶向修飾才有望從根本上解決基因隨機(jī)插入帶來(lái)的表達(dá)不可控等問(wèn)題[12]。相比于小鼠和大鼠以及大動(dòng)物家畜例如豬，家兔也是一種很好的選擇，既彌補(bǔ)了小鼠和大鼠與人類親緣關(guān)系遠(yuǎn)的不足又彌補(bǔ)了大動(dòng)物繁殖周期長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)耗費(fèi)高等的不足。家兔作為一種重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立一種高效、安全、快速及定點(diǎn)修飾的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將有助于推廣其在生物醫(yī)藥以及作為動(dòng)物模型來(lái)研究人類疾病的應(yīng)用。但是到目前為止，在家兔上還沒(méi)有獲得獲得具有生殖系嵌合的ES細(xì)胞或者iPS細(xì)胞，所以不能像小鼠那樣通過(guò)對(duì)ES或者iPS細(xì)胞進(jìn)行基因打靶結(jié)合囊胚注射獲得嵌合體的方法來(lái)獲得基因打靶兔[13]；同時(shí)因?yàn)榧彝玫捏w細(xì)胞核移植技術(shù)還不成熟，成功率比較低，所以也不能像家畜大動(dòng)物那樣通過(guò)對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行基因打靶結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)來(lái)獲得基因打靶兔。近年來(lái)，隨著新興基因修飾工具的出現(xiàn)，基因定點(diǎn)修飾兔已成為可能。2011年有實(shí)驗(yàn)室通過(guò)ZFN技術(shù)獲得IgM基因敲除兔[14]；2012年，本實(shí)驗(yàn)室利用TALEN基因打靶技術(shù)結(jié)合受精卵顯微注射技術(shù)已成功高效獲得RAG1和RAG2基因敲除兔。

CRISPR/Cas9技術(shù)是根據(jù)Ⅱ類CRISPR系統(tǒng)開(kāi)發(fā)而來(lái)，Ⅱ類CRISPR系統(tǒng)中有成熟的crRNA、tracrRNA和Cas9三種組分就可以行使切割DNA的功能?？茖W(xué)家們從細(xì)菌中提取純化出Cas9做的體外實(shí)驗(yàn)證明了這一點(diǎn)[15]。Bolotin等[16]首次將含有人工設(shè)計(jì)識(shí)別序列(相當(dāng)于細(xì)菌中的特異性間隔)的crRNA和tracrRNA融合為sgRNA(singleguide RNA，也稱gRNA)在體外實(shí)驗(yàn)中成功介導(dǎo)了Cas9切割目標(biāo)序列。引起切割的關(guān)鍵位點(diǎn)是PAMs(Protospacer-adjacent Motifs)區(qū)[17]，PAMs是識(shí)別位點(diǎn)3′端相連的幾個(gè)堿基，識(shí)別這個(gè)位點(diǎn)可使Cas9從識(shí)別構(gòu)象轉(zhuǎn)化為切割構(gòu)象[18]。由此，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)出了一套用gRNA/Cas9在真核細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯的方法[19]，通過(guò)Cas9切割DNA造成DSBs后介導(dǎo)NHEJ或者HDR，最終引起DNA序列發(fā)生目標(biāo)修飾。大量實(shí)驗(yàn)證明，CRISPR/Cas9技術(shù)打靶效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ZFN和TALEN技術(shù)[20]。自CRISPR/Cas9技術(shù)推出起，該技術(shù)一直是生物研究領(lǐng)域的大熱門，各種真核細(xì)胞和生物體中幾乎都可以用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因編輯，這些編輯可用于各種目的[21]。因?yàn)镃as9是共用的，多個(gè)gRNA共同應(yīng)用可以進(jìn)行多基因打靶，所以CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)勢(shì)之一是方便進(jìn)行多基因的編輯。另外，CRISPR/Cas9技術(shù)可應(yīng)用于成體動(dòng)物基因編輯研究，包括在成體動(dòng)物中進(jìn)行基因修復(fù)[22]和用Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠做活體內(nèi)的局部模型建立[23]，這些研究相對(duì)于ZFNs和TALENs而言是很大的突破。結(jié)合CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)在真核細(xì)胞、小鼠和大鼠上進(jìn)行多基因打靶的成功案例，本研究試圖利用該技術(shù)來(lái)建立家兔的基因打靶技術(shù)平臺(tái)。

ZFNs和TALENs針對(duì)一個(gè)靶基因要設(shè)計(jì)兩條ZFN或TALEN，兩個(gè)靶基因則要設(shè)計(jì)4條ZFN或TALEN而且每條ZFN或TALEN的設(shè)計(jì)復(fù)雜，構(gòu)建步驟繁瑣耗時(shí)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)最大的閃光點(diǎn)在于多基因打靶上的應(yīng)用。因?yàn)镃RISPR/Cas9系統(tǒng)中用于切割作用的Cas9蛋白是通用的，也就是說(shuō)當(dāng)需要對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行打靶時(shí)，只要導(dǎo)入多個(gè)基因的gRNA和一個(gè)Cas9質(zhì)粒即可，尤其是對(duì)于那些把RNA直接顯微注射到受精卵的方法獲得基因打靶動(dòng)物來(lái)說(shuō)更是大的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)間RNA的濃度在5～20 ng/μL以及cas9的mRNA濃度在200 ng/μL左右就能發(fā)揮很好的基因打靶效果，所以進(jìn)行多基因打靶的時(shí)候只需要多增加注射少量的RNA濃度即可，這樣對(duì)胚胎的毒性就會(huì)小很多。目前應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功進(jìn)行多基因打靶的哺乳動(dòng)物有小鼠[24]，大鼠[25]和猴子[26]。gRNA/Cas9系統(tǒng)除了可以定點(diǎn)敲除多個(gè)靶基因外，還可以通過(guò)HDR途徑對(duì)靶基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾或者通過(guò)單鏈寡核苷酸鏈(Singlestranded Oligo DNA，ssODNs)來(lái)引入兩個(gè)lox位點(diǎn)從而達(dá)到條件性基因打靶的目的[27]。

CRISPR/Cas9的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了基因定點(diǎn)修飾動(dòng)物的研究，為家兔等克隆效率低下又缺少全能性胚胎干細(xì)胞物種的基因修飾開(kāi)辟了新渠道。本研究所用gRNA的濃度為20 ng/μL,Cas9-mRNA為200 ng/μL，注射家兔受精胚胎的體外囊胚發(fā)育率在75%以上，說(shuō)明這個(gè)濃度對(duì)胚胎的發(fā)育影響不大。對(duì)這些發(fā)育正常的囊胚進(jìn)行基因打靶效率檢測(cè)，在這9個(gè)囊胚中，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序發(fā)現(xiàn)9個(gè)囊胚(100%)都發(fā)生了Tiki1基因打靶，其中在5個(gè)(56%)囊胚中檢測(cè)到WT的序列，我們定義為單等位基因敲除；剩下的4個(gè)(44%)沒(méi)有檢測(cè)到WT的序列是屬于雙等位基因敲除，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序發(fā)現(xiàn)9個(gè)囊胚(100%)都發(fā)生了Tiki2基因打靶，其中在6個(gè)(67%)囊胚中檢測(cè)到WT的序列，定義為單敲；剩下的3個(gè)(33%)沒(méi)有檢測(cè)到WT的序列是屬于雙敲。這個(gè)基因打靶效率比利用ZFN和TALEN技術(shù)(效率分別為50%和90%左右)在家兔上進(jìn)行基因打靶的效率高。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新興發(fā)展起來(lái)的高效的基因打靶工具，已經(jīng)受到了廣大科學(xué)家們的青睞，它除了廣泛應(yīng)用在傳統(tǒng)的基因敲除和基因敲入的研究上，最近還通過(guò)引入兩個(gè)loxP位點(diǎn)來(lái)達(dá)到條件性基因打靶的目的，此外還有科學(xué)家利用CRISPR系統(tǒng)來(lái)達(dá)到RNAi的作用來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。相信通過(guò)科學(xué)家們的繼續(xù)深入研究，CRISPR/Cas9系統(tǒng)技術(shù)會(huì)越來(lái)越完善，其潛力和價(jià)值會(huì)得到更全面的發(fā)現(xiàn)，對(duì)基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)和人類基因治療等諸多領(lǐng)域都會(huì)產(chǎn)生重大影響。

綜上所述，本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)家兔的雙基因打靶，建立了家兔雙基因打靶技術(shù)體系。高效的CRISPR/Cas9雙基因敲除兔系統(tǒng)的建立將為藥物研制開(kāi)發(fā)、器官移植、干細(xì)胞、脂代謝以及心腦血管等研究提供各種有價(jià)值的動(dòng)物模型。