鴨源大腸桿菌分離鑒定及其毒力基因檢測

李迎曉，焦鳳超，張李敏，楊露露，李洵，劉錦妮，吳海港，黃立，趙聘

(信陽農(nóng)林學(xué)院/河南省水禽資源開發(fā)利用與疫病防控工程技術(shù)研究中心， 河南 信陽 464000)

鴨大腸桿菌病是指由禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichia.coli, APEC)引起鴨全身或局部感染的疾病，在臨床上有大腸桿菌性敗血癥、臍炎、呼吸道型大腸桿菌病、輸卵管炎、腹膜炎、大腸桿菌性肉芽腫、腫頭綜合征、全眼球炎、滑膜炎、蜂窩織炎、腹水癥和鼻竇炎等多種病型[1]。 隨著養(yǎng)禽業(yè)集約化程度的提高和抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，鴨大腸桿菌病的發(fā)生越來越頻繁和復(fù)雜，大量耐藥菌株的出現(xiàn)再加上大腸桿菌血清型眾多，常引起繼發(fā)性局部或全身性感染，為該病的防制帶來一定的困難。

研究表明，APEC與人的新生兒腦膜炎大腸桿菌(neonatal meningitisE.coli, NMEC) 和人尿道源致病性大腸桿菌(uropathogenicE.coli, UPEC)關(guān)系密切，是潛在的人獸共患病原菌[2-3]。因此，加強禽致病性大腸桿菌流行病學(xué)監(jiān)測和防控，對養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展和獸醫(yī)公共衛(wèi)生具有重要意義。本研究采集信陽地區(qū)不同來源規(guī)模化養(yǎng)鴨場的疑似大腸桿菌感染病料，分離鑒定出19株鴨大腸桿菌，通過遺傳分群和毒力基因檢測，為闡明鴨源APEC的致病機理和有效防制大腸桿菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

信陽地區(qū)養(yǎng)殖戶送檢的疑似大腸桿菌感染病鴨，具有典型的心包炎、肝周炎和氣囊炎病理特征。

1.1.2 主要試劑

營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、腸桿菌科生化編碼管購自杭州天和微生物試劑有限公司；即用型Taq酶PCR試劑盒、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DL2000 DNA Marker購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 試驗動物

1日齡雛鴨購自河南華英農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離鑒定

無菌采集病死雛鴨肝臟、脾臟等病料劃線接種于麥康凱瓊脂，37 ℃培養(yǎng)24～36 h，挑取可疑菌落轉(zhuǎn)接種營養(yǎng)瓊脂純培養(yǎng)后，革蘭染色和瑞氏染色后檢查細菌形態(tài)。挑取營養(yǎng)瓊脂純化后的單菌落轉(zhuǎn)接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后待用。并將疑似細菌接種腸桿菌科生化編碼管(硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、葡萄糖產(chǎn)氣、賴氨酸、鳥氨酸、棉籽糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇和木膠醇)鑒定其生化特性，按照規(guī)定的時間培養(yǎng)和結(jié)果判定后，計算每株細菌的鑒定總值，查詢腸桿菌科GYZ-15e編碼鑒定手冊進行鑒定，具體操作按照腸桿菌科15項生化編碼管說明書進行。

1.2.2 引物的設(shè)計和合成

參照文獻[4-8]合成大腸桿菌堿性磷酸酶(phoA)，遺傳分群基因ChuA、yjaA和TspE4.C2p，外膜蛋白T(ompT)，鐵載體受體(iroN)，溶血素F(hlyF)，攝鐵系統(tǒng)(iutA)，血清抗性蛋白(Iss)，Ⅰ型菌毛(fimc)，鐵抑制蛋白(irp2)，鼠疫菌素受體(fyuA)和多重耐藥調(diào)控蛋白(marA)基因引物，引物具體信息見表1。

表1 PCR引物信息

目的基因引物名稱引物序列(5′～3′)片段大小/bp退火溫度/℃參考文獻phoAphoA-FGTGACAAAAGCCCGGACACCAGAAATGCCTphoA-RTACACTGTCATTACGTTGCGGATTTGGCGT90055[4]ChuAChuA-FGACGAACCAACGGTCAGGATChuA -RTGCCGCCAGTACCAAAGACA27959[5]yjaAyjaA-FTGAAGTGTCAGGAGACGCTGyjaA-RATGGAGAATGCGTTCCTCAAC21159[5]TspE4.C2TspE4.C2-FGAGTAATGTCGGGGCATTCATspE4.C2-RCGCGCCAACAAAGTATTACG15259[5]ompTompT-FTCATCCCGGAAGCCTCCCTCACTATTAompT-RGCGTTTGCTGCACTGGCTTCTGATAC49666[6]iroNiroN-FAATCCGGCAAAGAGACGAACCGCCTiroN-RGTTCGGGCAACCCCTGCTTTGACTTT53366[6]hlyFhlyF-FGGCCACAGTCGTTTAGGGTGCTTACChlyF-RGGCGGGTTTAGGGCATTCCGATACTCAG45066[6]iutAiutA-FGGCTGGACATCATGGGAACTGGiutA-RCGTCGGGAACGGTAGAATCG30266[6]ississ-FCAGCAACCCGAACCACTTGATGiss-RAGCATTGCCAGAGCGGCAGAA32366[6]marAmarA-FTCATTAGGCCAATACATCCGmarA-RGATTCACCCTGCATATTGGTC19253[7]fimCfimC-FCGTCAATGTAAGGAAATCGCAGGfimC-RGGCATTCAACTCTGTTACCGTC56550[7]fyuAfyuA-FGCTTTATCCTCTGGCCTTfyuA-RGGCATATTGACGATTAAC94752[8]irp2irp2-FAAGGATTCGCTGTAACCGGACirp2-RTCGTCGGGCAGCGTTCTTCT26752[8]

1.2.3 大腸桿菌的phoA基因PCR檢測

用針對phoA基因的引物對可疑菌株進行PCR檢測，PCR反應(yīng)體系50 μL： 2×TaqMaster Mix 25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板1 μL，超純水20 μL。擴增條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳進行檢測后，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4 大腸桿菌的遺傳分群

用針對ChuA、yjaA和TspE4C2基因的引物對可疑菌株進行PCR檢測和遺傳分群。PCR反應(yīng)體系50 μL： 2×TaqMaster Mix 25 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板1 μL，超純水20 μL。擴增條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳進行檢測后，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 致病性試驗

參考Rosenberger等[9]和吳信明等[10]方法，將19株大腸桿菌分離株肉湯過夜培養(yǎng)物分別氣管內(nèi)注射1日齡的雛鴨0.1 mL/羽(1×107CFU)，每組6只，同時設(shè)立對照組，氣管內(nèi)注射0.1 mL滅菌生理鹽水。攻毒后觀察7 d，每天記錄發(fā)病和死亡情況，并進行病理解剖觀察和細菌學(xué)檢查。致病性判定標準：50%及50%以上的接種鴨死亡為高致病菌株；接種鴨死亡不超過50%為中等致病菌株；接種鴨不死亡為低致病性菌株。

1.2.6 毒力基因的檢測

參照文獻[6-8]方法對19株鴨大腸桿菌病分離株的9種毒力基因ompT、iroN、hlyF、iutA、iss、marA、fimC、fyuA、irp2進行檢測。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳進行檢測后，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鑒定

分離菌在普通營養(yǎng)瓊脂平板形成白色、圓形隆起的菌落；在麥康凱瓊脂上形成紅色、圓形、隆起、光滑濕潤、邊緣整齊的菌落；挑取單個菌落革蘭氏染色后，在顯微鏡下可見革蘭氏陰性、散在或成對排列、兩端鈍圓的短桿菌。經(jīng)腸桿菌科15項生化編碼管共鑒定出19株大腸桿菌，分別命名為DE1～DE19。

2.2 大腸桿菌的phoA基因PCR檢測結(jié)果

19株分離菌均擴增出900 bp左右預(yù)期大小的條帶(圖1)，將目的條帶切膠回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，在線Blast結(jié)果表明其均為大腸桿菌phoA基因序列。

M. DNA Marker 2000;1～19. 分離菌DE1～DE19;20. 陰性對照

圖1phoA基因PCR檢測結(jié)果

2.3 大腸桿菌的遺傳分群

系統(tǒng)發(fā)育分子分群結(jié)果顯示19株分離株中10株(52.63%)屬于B2群，7株(36.84%)屬于D群，1株(5.26%)屬于B1群，1株(5.26%)屬于A群(表2、圖2)。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育分子分群結(jié)果

2.4 致病性試驗

試驗組雛鴨在接種之后普遍出現(xiàn)精神葁頓、食欲下降，大約12 h后開始出現(xiàn)死亡，剖檢變化可見心包積液，肝臟、脾臟充血或充血現(xiàn)象；病程較長的可見不同程度的肝周炎、心包炎和氣囊炎現(xiàn)象。并且均能從試驗組病、死鴨肝臟或脾臟中分離到大腸桿菌。19株分離菌中高致病性菌株9株(47.38%)，中致病性菌株7株(36.84%)，低致病性菌株3株(15.78%)，具體結(jié)果見表2。

2.5 毒力基因的檢測

19株鴨致病性大腸桿菌的毒力基因的檢測結(jié)果顯示，ompT、iroN、hlyF、iutA和Iss五種毒力基因的檢出率均為89.47%；fimC、marA和irp2基因檢出率為63.16%；fyuA基因檢出率為42.11%(圖3、表3)。

表2 19株大腸桿菌的部分生物學(xué)特性

菌株遺傳分群毒力基因致病性DE1B1fimc低DE2B2ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA、irp2、fyuA、fimc強DE3DompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA、irp2、fyuA、fimc強DE4B2ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、irp2、fimc低DE5DompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA、irp2、fyuA強DE6DompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA、irp2、fyuA、fimc強DE7DompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA、irp2中DE8DompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、fimc中DE9DompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、irp2強DE10B2ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA、irp2、fyuA、fimc強DE11B2ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、fimc中DE12B2ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA、irp2、fyuA強DE13DompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA、irp2中DE14B2ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA、irp2、fyuA、fimc強DE15B2ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、irp2、fyuA、fimc強DE16Afimc低DE17B2ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA中DE18B2ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA、fimc中DE19B2ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA中

M. 2000 bp DNA Marker;1-12.臨床分離株;13. 陰性對照

圖3fimC基因PCR擴增產(chǎn)物

表3 19株大腸桿菌的毒力基因分布

毒力基因菌株數(shù)比率/%ompT1789.47iroN1789.47hlyF1789.47iutA1789.47Iss1789.47fimc1263.16marA1263.16fyuA842.11irp21263.16ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss1789.47ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、marA1263.16

3 討論

本研究通過生化試驗、大腸桿菌phoA基因檢測共分離鑒定出19株鴨源大腸桿菌。根據(jù)Clermont等[5]建立的大腸桿菌系統(tǒng)發(fā)育分群方法，可以快速將大腸桿菌分為A、B1、B2和D群共4個群，其中A、B1群常存在于共生群，而B2和D群多為攜帶毒力相關(guān)基因的腸道外致病性病原體[5]。董向磊[11]對240個APEC分離株進行種系發(fā)生分型分析，80株(33.33%)屬于D型，39株(16.25%)屬于B2型，62株(25.84%)屬于A型，其余59株(24.58%)為B1型。而胡林[12]對77株APEC分離株進行種系發(fā)生分型分析發(fā)現(xiàn)，B2群和D群為51%，A群和B1群則為49%。王龍光等[13]對來自山東等10省份698株雞源大腸桿菌進行系統(tǒng)發(fā)育分群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低致病群B1群48.85%和非致病群A群24.64%分布較多，高致病群D群20.20%和B2群為6.31%。本研究對信陽地區(qū)19株APEC分離株進行系統(tǒng)發(fā)育分群，結(jié)果顯示10株(52.63%)屬于B2群，7株(36.84%)屬于D群，1株(5.26%)屬于B1群，1株(5.26%)屬于A群。致病性試驗顯示19株細菌均具有致病性，且具有中等以上致病性的菌株絕大多數(shù)(16/19)屬于B2和D群，基本反映出此次分離出的鴨致病性大腸桿菌在系統(tǒng)進化分群上的特點，與其他學(xué)者的研究結(jié)果存在部分差異，也說明APEC在不同地區(qū)存在不同的生態(tài)分布。

禽致病性大腸桿菌含有多種毒力因子，如與定居相關(guān)的黏附素、耶爾森菌強毒力島、攝鐵系統(tǒng)、抗血清活性因子、溶血素、溫度敏感性血凝素、侵襲素和空泡形成毒素等[14-15]。APEC致病性的高低是多種毒力因子協(xié)同作用的結(jié)果，可通過針對ompT、iroN、hlyF、iutA和Iss五種毒力基因的多種PCR方法對禽致病性大腸桿菌做出快速診斷，檢測準確率為85.4%[6]。本研究選定9個主要毒力因子的編碼基因：ompT(細菌防御因子)、iroN(攝鐵系統(tǒng))、hlyF(溶血素)、iutA(攝鐵系統(tǒng))、Iss(抗血清存活因子)、fimc(Ⅰ型菌毛)、irp2(耶爾森菌強毒力島)、fyuA(耶爾森菌強毒力島)和marA(多重耐藥調(diào)控基因)，對19株鴨致病性大腸桿菌的毒力基因的檢測結(jié)果顯示，ompT、iroN、hlyF、iutA和Iss五種毒力基因的檢出率均為89.47%；fimC、marA和irp2基因檢出率為63.16%；fyuA基因檢出率為42.11%。同時攜帶ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss和marA基因細菌比列為63.16%，是主要的基因組合。而動物致病性結(jié)果顯示，19株分離菌均具有不同的致病性，16株(84.21%)細菌具有中等以上的致病性，與所檢測的5種毒力基因(ompT、iroN、hlyF、iutA和Iss)89.47%的檢出率，存在基本的對應(yīng)關(guān)系，但不存在絕對的對應(yīng)關(guān)系。本研究中fimC基因有63.16%的檢出率，且所對應(yīng)的菌株2株為低致病性，10株為中等或高致病性，與王亞君等[16]fimC可以作為高致病力雞大腸桿菌的標志基因的研究結(jié)果存在差異；于學(xué)輝等[17]的研究結(jié)果表明fimC在鴨大腸桿菌病分離株和臨床健康鴨大腸桿菌分離株中的攜帶率差異不顯著。以上結(jié)果說明可能存在其他的致病因子，或者是多種致病因子協(xié)同作用的結(jié)果，這也與相關(guān)的報道存在一致性[2,4,12]。而鄧伯雄等[7]對27株鴨致病性大腸桿菌檢測中ompT、iroN、hlyF、iutA、Iss、fyuA、irp2、Tsh和papA基因陽性率均為100%。于學(xué)輝等[17]檢測了210株鴨致病性大腸桿菌分離株和28株臨床健康鴨大腸桿菌分離株fyuA、irp2、imc、papA和iss基因的攜帶情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鴨致病性大腸桿菌分離株5種基因的攜帶率顯著高于健康鴨大腸桿菌分離株，與本研究結(jié)果存在一定的差異，提示本次分離的19株鴨源大腸桿菌毒力因子與致病能力的關(guān)系有待進一步研究。

本研究確定信陽地區(qū)19株鴨源APEC分離株的系統(tǒng)發(fā)育分群和毒力基因攜帶情況，為信陽地區(qū)鴨大腸桿菌病的防治提供了科學(xué)依據(jù)。