羊源大腸桿菌血清型鑒定、毒力基因檢測(cè)及耐藥性分析

王顯峰，白金英

(內(nèi)蒙古扎蘭屯職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 扎蘭屯 162650)

腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)可以引起多種動(dòng)物呼吸道、泌尿道等腸道外感染，其感染率和死亡率均較高，成為危害養(yǎng)殖業(yè)主要的病原菌之一[1]。ExPEC根據(jù)其致病性特性可以分為尿道致病性大腸桿菌(UPEC)、新生兒腦膜炎致病性大腸桿菌(NMEC)、子宮內(nèi)膜致病性大腸桿菌(EnPEC)、肺炎致病性大腸桿菌(PPEC)、敗血癥性大腸桿菌(SEPEC)、乳腺炎致病性大腸桿菌(MPEC)等[2]。相關(guān)研究表明了ExPEC是人類源致病性大腸桿菌的貯存庫(kù)，具有人畜共患的特性，對(duì)人類的健康具有潛在性的威脅[3]。

大腸桿菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，擁有多種O抗原血清型，具有地區(qū)流行性特點(diǎn)，且不同血清型菌株之間沒有交叉免疫保護(hù)性，目前沒有有效疫苗，是導(dǎo)致該菌在動(dòng)物養(yǎng)殖過程廣泛流行主要原因之一[4]。ExPEC基因組攜帶多種毒力基因，其致病性可以通過攜帶的相關(guān)毒力因子使ExPEC定植于動(dòng)物黏膜表面，破壞動(dòng)物的免疫系統(tǒng)，致使其動(dòng)物機(jī)體免疫力下降，引起宿主發(fā)病[5]。許多研究表明ExPEC攜帶毒力基因與其致病性具有一定的相關(guān)性[6]。臨床中抗生素是控制大腸桿菌病的主要手段，由于抗菌藥物大量不合理使用導(dǎo)致致病性大腸桿菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，并產(chǎn)生廣譜的耐藥性[7]。因此，在動(dòng)物大腸桿菌病治療過程中應(yīng)該引起重視。本試驗(yàn)從扎蘭屯地區(qū)采集的羊鼻腔拭子150份中分離得到45株大腸桿菌，并對(duì)其血清型、毒力基因及耐藥性進(jìn)行檢測(cè)與分析，為大腸桿菌病的防控及臨床用藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料

2018-2019年從扎蘭屯地區(qū)采集患有呼吸困難、流鼻涕的病羊的羊鼻腔拭子150份。

1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自(北京索萊寶科技有限公司)；2×TaqMarker Mix購(gòu)自(寶生物(大連)公司)；DNA 2000Marker購(gòu)自(北京中科瑞泰生物科技公司)大腸桿菌桿菌顯色培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)肉湯均購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；陰性菌鑒定試條、14種抗菌藥物購(gòu)自北京三佳拓聯(lián)科技發(fā)展有限公司；7%綿羊血培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體質(zhì)量為(20±2.2)g健康昆明系小鼠350只，由本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 細(xì)菌分離鑒定

將鼻腔拭子接種于大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12～18 h，挑取大腸桿菌顯色培養(yǎng)基接種于7%綿羊血培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)12～18 h。用營(yíng)養(yǎng)肉湯中進(jìn)行純化培養(yǎng)，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生化試驗(yàn)鑒定。

1.5 細(xì)菌PCR鑒定

設(shè)計(jì)細(xì)菌通用16S rRNA引物，P1:5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′，P25′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′基因片段為1 429 bp，由上海生工生物工程有限公司合成。利用細(xì)菌基因組DNA提取分離菌株的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將分離菌株的PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行基因測(cè)序。

1.6 細(xì)菌致病性試驗(yàn)測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]，將純化的分離菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期計(jì)數(shù)，每株菌株腹腔注射5只小鼠，劑量為0.2 mL(1.0×106CFU/mL)，對(duì)照組給予PBS，觀察7 d，記錄死亡情況，進(jìn)行病原菌分離鑒定。

1.7 細(xì)菌血清型檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[9]，將分離菌株121 ℃滅菌2 h，破壞K抗原，用玻板凝集試驗(yàn)檢測(cè)其分離菌株血清型。

1.8 細(xì)菌毒力基因檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[10]，設(shè)計(jì)14種毒力基因引物，其中包括黏附素因K99、溶血素基因(hlyE、Ehly、Ehly、hlyA)、腸毒素基因(LT、STa、STb)、HPI毒力島(irp2、fyuA)、LEE毒力島(Ler、eaeA)、志賀菌毒素(stx1、stx2)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以提取分離菌株的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其攜帶毒力基因，PCR體系和條件反應(yīng)參照文獻(xiàn)[10]，將分離菌株的PCR產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行基因測(cè)序。

表1 毒力基因引物

毒力基因引物序列(5'-3')產(chǎn)物大小/bp退火溫度/℃K99TCCTGGGACATAATGGCTAGGTGTCAGAACGGAATTGTC98158hlyAGTGGCAGTATGAGTAATGACCGTATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATATT50157hlyEGGGTAGAAAATGCCGATGGTGCGTCATTTTGGGGGTAAGTGC49757EhxTCATCCCGGAAGCCTCCCTCACTACTATTAGCGTTTGCTGCACTGGCTTCTGATAC49666EhlyAATCCGGCAAAGAGACGAACCGCCTGTTCGGGCAACCCCTGCTTTGACTTT55366LTACAAAAAGTTCTATCGCTTCCCCTGATCCAGATGATGCTC71457STaGGCTGGACATCATGGGAACTGGCGTCGGGAACGGGTAGAATCG30266STbGAACGGCGGACTGTTAATTTGAACATTCAGAGTACCGGG139158LerCGCACACAACAAGCCCATACGATGAGTTCCGGCAGGCAA19558eaeATAACGGCTATTTCCGCATGATCC CAGACGATACGATCCAG55258irp2AAGGATTCGCTGTTACCGGATCGGCCAGGATGATTCGTCG30152fyuAACACGGCTTTATCCTCTGGCGGCATATTGACGATTAACGAA95358stx1TACTAATGCCATATAGCCCCATAAGAGCTGTTTGTAGCGAAGCC116057stx2ACTATTCTCTGCAGAAGTCCCTCCGATTCTGAACGT82459

1.9 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

分離菌株的藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2017推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行試驗(yàn)操作和結(jié)果判斷，統(tǒng)計(jì)其耐藥數(shù)據(jù)，分析其耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

疑似大腸桿菌在大腸桿菌桿菌顯色鑒別培養(yǎng)基上長(zhǎng)出邊緣整齊的、光滑的綠色菌落，在7%綿羊血培養(yǎng)基長(zhǎng)出大小一致、邊緣整齊的、光滑的菌落，呈現(xiàn)β溶血(圖1)；染色鏡檢為分離菌株呈現(xiàn)陰性的兩端鈍圓桿狀菌 (見圖2)。分離菌株分解半乳糖、葡萄糖、蔗糖，甘露糖、麥芽糖、且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣； V-P試驗(yàn)為陰性。 用ATB全自動(dòng)生化鑒定為大腸桿菌，其合格率為99.5%～100%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)共獲得69株大腸桿菌。

圖1 分離菌株β溶血

圖2 分離菌株革蘭氏染色(1 000×)

2.2 細(xì)菌的PCR鑒定

69株分離菌株使用通用16S rRNA引物均擴(kuò)增出1 429 bp的目的基因條帶(見圖3)，測(cè)序結(jié)果顯示69株分離菌株與大腸桿菌參考菌株16S rRNA基因序列的同源性在98.9%～99.9% 之間，被鑒定為大腸桿菌。

M. DL2000 Marker;1～13. 分離菌株;7. 空白對(duì)照

圖3 部分分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 細(xì)菌致病性試驗(yàn)

攻毒組小鼠在攻毒后3～4 d，出現(xiàn)精神沉郁、采食量減少，個(gè)別小鼠不表現(xiàn)任何癥狀出現(xiàn)急性死亡，從死亡的小鼠的體內(nèi)分離到大腸桿菌，對(duì)照組小鼠健康存活。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，45株大腸桿菌能引起小鼠死亡。

2.4 血清型檢測(cè)

由表1可知， 45株大腸桿菌分屬10個(gè)血清型，其中O111、O127、 O38 為該地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)血清型，分別占致病菌株的26.7%、22.2%和17.8%。

表1 大腸桿菌血清型檢測(cè)

血清型檢出菌數(shù)/株所占比例/%O1424.4O5212.2O5624.4O38817.8O2436.7O9812.2O8924.4O15148.9O1111022.2O1271226.7

2.5 分離菌株毒力基因檢測(cè)

對(duì)分離的45株大腸桿菌，用PCR法檢測(cè)14種毒力基因，結(jié)果見表2。 45株大腸桿菌中毒力基因irp2、fyuA、hlyA、hlyE檢出率較高，在88.9%～100%之間；Ler、eaeA、Ehly檢出率在33.3%～44.4%之間；Ehx、stx1、stx2檢出率較低，在4.4%～14.3%之間；LT、Sta、STb、K99未檢出。

表2 大腸桿菌毒力基因檢測(cè)

毒力基因檢出菌株數(shù)檢出率/%毒力基因檢出菌株數(shù)檢出率/%irp245100.0Ehly1942.2fyuA45100.0LT00Ler2044.4STa00eaeA1533.3STb00hlyA4293.3K9900hlyE4088.9stx124.4Ehx614.3stx236.7

2.6 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可知，分45株大腸桿菌對(duì)氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、新霉素、紅霉素5種藥物耐藥率在88.9%～1000%之間；對(duì)慶大霉素、強(qiáng)力霉素、多黏菌素、氟苯尼考4種藥物耐藥率在53.3%～77.8%之間；對(duì)頭孢噻呋、環(huán)丙沙星、林可霉素、大觀霉素、恩諾沙星5種藥物耐藥率相對(duì)較低，耐藥率在13.3%～26.7%之間。

表3 大腸桿菌耐藥性分析

藥物耐藥菌株數(shù) 耐藥率/%藥物耐藥菌株數(shù) 耐藥率/%頭孢噻呋613.3強(qiáng)力霉素2657.8阿莫西林45100.0磺胺間甲氧嘧啶4088.9氨芐西林4497.8大觀霉素920.0恩諾沙星1226.7林可霉素613.3環(huán)丙沙星817.8多黏菌素3271.1新霉素3992.9紅霉素4293.3慶大霉素3577.8氟苯尼考2453.3

3 討論

大腸桿菌是重要的人畜共患病原之一，可引起多種動(dòng)物發(fā)病[10-12]。本試驗(yàn)從150份患羊鼻拭子中分離得到了69株大腸桿菌，通過人工感染小鼠試驗(yàn)，證實(shí)45株具有致病性，說明大腸桿菌可能對(duì)羊存在潛在威脅，應(yīng)引起重視。因此，對(duì)分離的45株大腸桿菌進(jìn)行血清型、毒力基因檢測(cè)及耐藥性分析。結(jié)果表明， 45株大腸桿菌分屬10個(gè)血清型，其中O111、O127、 O38 為該地區(qū)流行的優(yōu)勢(shì)血清型，說明該地區(qū)分離的大腸桿菌血清型復(fù)雜，具有多樣性。

大腸桿菌致病過程與其攜帶的毒力基因有關(guān)， HPI毒力島、LEE毒力島可編碼多種毒力基因，是致病性大腸桿菌的標(biāo)志性基因，與其致病性密切相關(guān)[8-9]。有研究表明溶血素是引起致病性大腸桿菌的重要毒力因子，主要包括α- 溶 血 素 (HlyA)、腸溶血素(EhxA)、溶細(xì)胞素 A (ClyA)，這些溶血素基因具有廣譜的細(xì)胞溶解性，可以造成嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，在大腸桿菌致病中發(fā)揮重要作用[10]。本試驗(yàn)中， 45株大腸桿菌分離株毒力基因irp2、fyuA、hlyA、hlyE、Ler、eaeA、Ehly的檢出率在33.3%以上，其他毒力基因檢出率在4.4%～14.3%之，特別是irp2、fyuA、hlyA、hlyE檢出率在88.9%～100%之間，說明這4種毒力基因在大腸桿菌分離株中廣泛流行，可能與菌株毒力有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

大腸桿菌的耐藥性可通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種方式在不同血清型菌株之間傳播，使抗菌藥物敏感菌株成為耐藥菌株，且可以出現(xiàn)多重耐藥性產(chǎn)生[13]。本試驗(yàn)研究表明，分離菌株對(duì)氨芐西林、阿莫西林、新霉素等9種藥物耐藥率在53.3%以上，對(duì)其他藥物的耐藥率在13.3%～26.7%之間，說明該地區(qū)大腸桿菌分離株耐藥性嚴(yán)重，應(yīng)引起重視。