玻璃化冷凍對小鼠卵母細胞透明帶的影響

季珂萌，成俊萍,2，王勇杰，張潤祥，白熙，唐小川，王曉麗*

(1. 廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005；2. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021)

近年來，卵母細胞的冷凍研究越來越受到研究者關注。冷凍保護劑對于卵母細胞的冷凍效果、細胞損傷情況至關重要，因此對于冷凍保護液配方的研究層出不窮，目前還沒有可以讓國內外相關研究學者統(tǒng)一使用的配方。而且卵母細胞保存過程仍存在許多缺陷。冷凍保存可降低卵母細胞質量，使卵母細胞透明帶變硬，這些損傷可導致低受精率和發(fā)育潛力[1]。透明帶(zona pellucida，ZP)在受精、早期胚胎發(fā)育和著床過程中起著重要作用[2]，最早出現(xiàn)在初級卵泡中，由卵母細胞和卵泡細胞共同分泌。ZP特征反映了卵母細胞的發(fā)育潛力[3-4]，與成熟期和受精期相關[5]。卵母細胞透明帶厚度(zona pellucida thickness，ZPT)、透明帶厚度變量(zona pellucida thickness variance，ZPTV)和透明帶雙折射(zona pellucida birefringence，ZPB)是檢測卵母細胞透明帶的主要參數(shù)[6-8]。本研究通過比較卵母細胞的存活率、受精率、卵裂率和囊胚形成率，探討了四種冷凍保護液配方在小鼠卵母細胞中的應用效果。此外，還檢測了ZPT、ZPTV、ZPB和超微結構，以進一步評估卵母細胞玻璃化的損傷。為改進玻璃化冷凍方法，提高玻璃化冷凍復蘇后卵母細胞受精率提供研究思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

4～5周齡雌性昆明白小鼠購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 玻璃化冷凍載體(cryoleaf)的制備

以0.25 mL普通麥管為材料，將麥管有棉塞的部分剪去，然后一分為二。取其中一根麥管，在其一端用解剖刀剪成約20 mm長、2 mm寬的矩形薄片。

1.1.3 操作液

卵巢及卵丘卵母細胞復合體操作液：M2液。卵母細胞操作液及培養(yǎng)液：M199+5%FBS(胎牛血清)。

1.1.4 玻璃化冷凍液體

基礎液(HM)：TCM199+20%FCS；FS：0.3 g·mol/L聚蔗糖+0.5 mol/L蔗糖+HM；EDFS液：EG∶DMSO∶FS=1.5∶1.5∶7(V/V)的比例混勻。4組冷凍保護液配方如表1。

表1 4種冷凍液配方

組別平衡液冷凍液1HM+7.5%EG+7.5%DMSOHM+15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L Su2HM+7.5%EG+7.5%DMSO+0.5 mol/L SuHM+15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L Su3HM+10%EG+10%DMSOHM+20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L Su4HM+10%EG+10%DMSOEDFS液

注:HM∶EG∶DMSO體積比V∶V∶V

解凍液①：HM+1mol/L Su；解凍液②：HM+0.5mol/L Su；解凍液③：HM

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞采集

飼喂于25 ℃、自然采光條件下的4～5周齡的雌性小鼠，注射PMSG 10 IU/只，48 h后注射hCG 10 IU/只，13～16h后在輸卵管膨大部中收集卵丘卵母細胞復合體(COCs)。將COCs移入含300 IU/mL透明質酸酶的M2液中，在37 ℃恒溫臺上輕輕吹打數(shù)次，收集形態(tài)正常有第一極體的卵母細胞于卵母細胞操作液中洗凈后供實驗用。

1.2.2 體外受精

取雄性小鼠附睪，擠刮出精液于平衡8 h的受精液 HTF液滴中，置于培養(yǎng)箱10 min，使精子分散上浮。然后用寬徑槍頭吸取液面精子移入下一個平衡好的HTF液中，放入培養(yǎng)箱1.5～2 h使精子獲能。將精子懸液用HTF液稀釋，觀察受精活力并將濃度調至(1～2.5)×106個/mL。卵母細胞洗凈后移入稀釋后的精子懸液中，放入培養(yǎng)箱中5～6 h后，顯微鏡下觀察，卵母細胞內看到第二極體和雙原核出現(xiàn)則表示已受精。將受精成功的卵母細胞用操作液洗兩次后移入培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)16～24后觀察卵裂情況；5～7 d后觀察囊胚情況。

1.2.3 卵母細胞玻璃化冷凍-解凍

冷凍：將試驗所需的溶液及器具于37 ℃溫箱中充分平衡。將卵母細胞移入預處理液中平衡5 min后，移入玻璃化冷凍液，在1 min內將卵母細胞移到cryoleaf上，并盡量吸走多余的冷凍液，迅速投入液氮中冷凍保存。解凍：將cryoleaf從液氮中取出后，迅速將其前段浸入解凍液①中1 min，在顯微鏡中回收卵母細胞后移入解凍液②中3 min，最后移入卵母細胞培養(yǎng)液。洗凈后，挑選形態(tài)正常的卵母細胞置于卵母細胞培養(yǎng)液放入CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2，濕度100%)中培養(yǎng)10 min。

1.2.4 電鏡樣品制備及觀察

各組卵母細胞經戊二醛前固定和四氧化鋨后固定，用二甲胂酸鈉水洗，乙醇梯度脫水，六甲基二硅胺烷干燥和真空干燥，最后采取多次短時的方式進行離子噴鍍，在掃描電子顯微鏡(SEM，VEGA3 TESCAN)下觀察采集圖像。

1.2.5 ZPT和ZPB檢測

各組透明帶ZPB和ZPT檢測方法如文獻[7]所述；ZPTV計算 ZPTV=(透明帶最厚值-透明帶平均厚度值)/透明帶平均厚度值×100

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

ZPT、ZPTV和ZPB結果以(平均值±SEM)表示，SPSS軟件根據(jù)方差齊性選擇檢驗方法比較各組間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同玻璃化冷凍保護液對卵母細胞的影響

卵母細胞分組后，除對照組外，各組分別經過玻璃化冷凍及復蘇，發(fā)現(xiàn)解凍后的卵母細胞有部分出現(xiàn)胞質輕微固縮、破碎或過度脹大，細胞透明帶脫落，體外受精后部分卵母細胞分裂不均勻或沒有分裂(如圖1)?；謴团囵B(yǎng)2 h后，體外受精，記錄相關數(shù)據(jù)并進行統(tǒng)計分析，如表2所示，1-4組玻璃化冷凍復蘇后存活率和受精率均顯著低于對照組(P<0.05)。1組存活率顯著高于4組(P<0.05)，受精率顯著高于2組(P<0.05)，其余各組無統(tǒng)計學差異，卵裂率及囊胚率各組無統(tǒng)計學差異，但均低于對照組，且1組均高于其他冷凍液組。因此選用對卵母細胞發(fā)育潛力損傷最小的1組(HM+7.5%(DMSO+EG)，HM+15%(DMSO+EG)+0.5 mol/L Su)進行后續(xù)的試驗。

a:正常卵母細胞；b:解凍后透明帶脫落；c:均勻卵裂；d:卵裂不均勻

圖1 玻璃化冷凍對卵母細胞形態(tài)的影響

表2 不同玻璃化冷凍保護液對小鼠卵母細胞發(fā)育能力的影響(n=3)

組別卵母細胞數(shù)存活率/%受精率/%卵裂率/%囊胚率/%18486.90±0.20a69.86±0.15a74.51±0.03ab60.53±0.02ab210976.15±0.14ab54.22±0.12b73.33±0.03ab57.58±0.07ab38383.13±0.03ab55.07±0.07ab65.79±0.09a56.00±0.96ab49174.73±0.10b67.65±0.04ab76.09±0.09ab51.43±0.02a對照組97100±0.00c87.63±0.03c82.35±0.02b72.86±0.05b

注：同一列中具有不同上標為顯著差異，P<0.05。下同

2.2 玻璃化冷凍對透明帶厚度、厚度變量和雙折射分值的影響

選用2.1中對卵母細胞發(fā)育潛力損傷最小的冷凍液，分別檢測對照組、冷凍液處理組(過冷凍液，不經冷凍程序)和冷凍組卵母細胞透明帶ZPB和ZPT，并計算ZPTV。結果發(fā)現(xiàn)，見表3，冷凍組的ZPT值、ZPB值顯著大于對照組和冷凍液處理組(P<0.05)，冷凍液處理組的ZPT和ZPB與對照組相比差異不顯著。三組的ZPTV差異不顯著。

表3 玻璃化冷凍對小鼠卵母細胞ZPT、ZPTV和ZPB的影響

組別卵母細胞數(shù)透明帶厚度/μm厚度變量ZPTV雙折射分值ZPB對照組1565.77±0.60a13.27±0.491.22±0.21a處理組805.74±0.33a14.16±0.731.31±0.41a冷凍組656.05±0.10b14.54±0.950.30±0.38b

通過對上述結果進一步用Pearson法分析，見表4，ZPT與ZPB相關關系顯示出ZPT值隨ZPB增大而減小r=-0.299(P<0.05)，兩者呈負相關；ZPTV與ZPB之間無相關關系。

表4 卵母細胞ZPT、ZPTV和ZPB之間的相關性

ZPTZPTVZPBPearson correlation-0.299-0.026Sig.(2-tailed)0.0000.725Data NO.301301

2.3 玻璃化冷凍卵母細胞透明帶超微結構的變化

將各組卵母細胞處理后在掃描電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大部分卵母細胞透明帶完整的包裹卵母細胞，表面十分粗糙，呈粗網狀或不規(guī)則窗孔狀(如圖2a-b)，部分卵母細胞透明帶雖然完整，但表面較平滑，網狀結構已不清晰，只見小而淺的小孔(如圖2c-d)；一些卵母細胞出現(xiàn)透明帶呈熔融狀，表面凹凸不平但不粗糙，網孔結構融化消失(如圖2e-f)，甚至出現(xiàn)卵母細胞透明帶破裂，與卵母細胞分離，脫落(如圖2g-h)。

經過統(tǒng)計分析，如表5所示，發(fā)現(xiàn)三組中冷凍組的粗ZP率最低(44.8%對92.9%和84.8%)(P<0.05)，而光滑ZP率最高(31.0%對7.4%和9.1%)(P<0.05)。同時，冷凍液處理組和冷凍組的ZP熔融率也高于對照組。

a-b:正常卵母細胞粗糙透明帶表面，c-d:卵母細胞透明帶表面部分光滑，e-f: 卵母細胞透明帶熔融狀，g-h:卵母細胞透明帶部分脫落

圖2 玻璃化冷凍對卵母細胞超微結構的影響

表5 玻璃化冷凍對卵母細胞透明帶超微結構的影響

組別卵母細胞數(shù)粗ZP/%光滑ZP/%熔融ZP/%破裂ZP/%對照組2792.9 (25/27)a7.4 (2/27)a0 (0/27)a0 (0/27)處理組3384.8 (28/33)a9.1 (3/33)a6.1 (2/33)ab0 (0/33)冷凍組2944.8 (13/29)c31.0 (9/29)c17.2 (5/29)bc6.9 (2/29)

3 討論

卵母細胞玻璃化冷凍研究雖然取得了顯著進展，然而冷凍復蘇后卵母細胞的發(fā)育潛力仍低于新鮮卵母細胞[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，乙二醇(EG)的滲透性最好毒性最低，而二甲基亞砜(DMSO)的玻璃化能力較強。目前，綜合冷凍保護劑的冷凍保護效果和細胞毒性，EG和DMSO聯(lián)合使用的冷凍液保護配方較為廣泛[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，使用15%EG、15%DMSO、0.5 M蔗糖和20%胎牛血清對大鼠卵母細胞進行玻璃化冷凍復蘇后，可以獲得最佳的存活率和卵裂率，但透明帶精子穿透率低，皮質顆粒胞吐率高[1]。本研究也發(fā)現(xiàn)，HM+7.5%(DMSO+EG)，HM+15%(DMSO+EG)+0.5 mol/L Su冷凍液配方對小鼠卵母細胞發(fā)育潛力影響較小。其原因可能是在細胞冷凍的平衡過程中，防止細胞內結冰或暴露在高溶質濃度的溶液中造成細胞損傷[11]。盡管如此，卵母細胞損傷仍然存在，這可能與冷凍保護劑濃度高引起的細胞毒素以及冷凍過程中環(huán)境溫度過低引起的各種卵母細胞結構變化有關[12]。

ZPT是通過透明帶評估卵母細胞質量的指標之一，有試驗證實，ZPT小的卵母細胞更容易受精[5]。ZPTV是一個反映透明帶厚薄均勻程度的指標，值越大說明透明帶厚薄越不均勻。ZPTV較大的胚胎妊娠率較高，因此ZPTV也是一個通過透明帶評估卵母細胞及胚胎質量和發(fā)育潛力的重要指標之一。在本研究中發(fā)現(xiàn)，冷凍組ZPT顯著高于對照組和處理組，但ZPTV與其他兩個組差異不顯著。此結果表明，玻璃化冷凍主要使得卵母細胞透明帶變厚，進而使得冷凍復蘇后卵母細胞受精率降低；同時，玻璃化冷凍不會影響透明帶厚薄均勻程度，可見玻璃化冷凍復蘇的卵母細胞成功受精后的妊娠率所受影響不大，這也與其他人的研究結果相符[13]。此外，處理組的ZPT和ZPTV均和對照組差異不顯著，反映出冷凍保護液不影響透明帶的厚度及厚度變量，據(jù)此推斷玻璃化冷凍后卵母細胞透明帶厚度的變化主要是由冷凍低溫環(huán)境造成的。

ZPB與其大分子結構相關，ZPB的變化意味著透明帶的大分子結構出現(xiàn)變化。研究證實，ZPB與體外受精率及囊胚形成有關，且ZPB越大發(fā)育潛力越好[14-15]。本研究結果可見冷凍組ZPB顯著低于處理組和對照組，處理組和對照組之間差異不顯著，由此可知，玻璃化冷凍過程中的低溫環(huán)境對透明帶大分子結構造成了不良影響，使得ZPB降低，表明這種不良影響引起玻璃化冷凍復蘇的卵母細胞體外受精率及囊胚形成率降低。Bogliolo等[16]用Raman射線探究玻璃化冷凍對透明帶分子結構的變化，證實了玻璃化冷凍復蘇后的卵母細胞透明帶結構發(fā)生了變化。在本研究中，用掃描電鏡檢測ZP發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍復蘇后卵母細胞透明帶結構發(fā)生部分改變，而新鮮卵母細胞和只經歷冷凍程序沒有液氮冷凍的卵母細胞間差異不顯著，這個研究結果與前人研究結果相一致。

進一步分析ZPT、ZPTV和ZPB的相關性發(fā)現(xiàn)ZPT和ZPB之間存在顯著負相關，而ZPTV和ZPB之間相關性不顯著?？梢酝茢啵ＡЩ鋬鰧β涯讣毎该鲙У姆肿咏Y構有顯著影響，這種影響可能導致透明帶厚度整體變大而不是局部變厚，這些變化均導致透明帶與精子的作用受到影響，進而使得卵母細胞玻璃化冷凍復蘇后受精率下降。而根據(jù)處理組和對照組之間差異不顯著的結果，可推斷玻璃化冷凍對卵母細胞物理特性的影響不是冷凍保護劑的細胞毒性，可能是低溫環(huán)境或者其他不良因素造成的。此外，ZPT和ZPB間存在的相關性也側面證實ZPT作為評估卵母細胞及胚胎質量指標的可靠性，在ZPB測量存在一定困難的條件下，ZPT從一定程度上也能體現(xiàn)ZPB所能指示的結果。