血清Adropin蛋白和腦啡肽酶在2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中的變化及影響因素

張?？担顚毿?，李 娜，翟 娜，張云良，劉莉芳，王 翯，郭淑芹

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)作為糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，隨著病情的發(fā)展會逐漸影響人們的視力水平，也是不可逆性致盲最常見的病因。因此對DR的發(fā)生、發(fā)展機制及其影響因素的研究越來越引起人們的關(guān)注。有研究顯示，DR的發(fā)生、發(fā)展不僅與血糖控制水平，而且與血管內(nèi)皮功能有著密不可分的關(guān)系[1]。Adropin蛋白(AD)是新發(fā)現(xiàn)的一類生物活性蛋白，由 76 個氨基酸組成，具有調(diào)節(jié)能量代謝、改善血管內(nèi)皮細胞功能的重要作用[2]。而且有研究顯示，在糖尿病小鼠組血清中AD水平明顯低于非糖尿病小鼠組，表明AD在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中有一定作用[3]。腦啡肽酶(neprilysin，NEP)是位于細胞表面的Ⅱ型膜蛋白，是含鋅的金屬肽酶，在機體中廣泛存在，具有調(diào)節(jié)糖尿病患者血管內(nèi)皮細胞功能的重要作用[4-5]。但是AD和NEP兩個因子在DR的發(fā)生、發(fā)展中是否起一定作用，以及二者相互作用關(guān)系尚未明確。因此本研究旨在觀察AD和NEP水平在不同程度DR患者血清中的變化并分析其影響因素，進而為研究DR的發(fā)生、發(fā)展機制提供理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1對象收集2017-10 /2019-01符合1999年WHO糖尿病診斷標準[6]并且于在保定市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的2型糖尿病(T2DM)患者167例。所有受試對象均行散瞳，由2名有經(jīng)驗的醫(yī)師行直接眼底鏡和眼底熒光血管造影檢查，根據(jù)臨床DR嚴重程度的分級標準[7]，將患者分為單純2型糖尿病組(DM組)59例，2型糖尿病合并視網(wǎng)膜病變組(DR組)108例，DR組包括非增殖期視網(wǎng)膜病變組(NPDR組)45例和增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病組(PDR組)63例。另外選取于我院健康體檢者57例作為正常對照組(NC組)。納入標準：(1) 符合1999年WHO正常糖代謝、糖尿病和DR的診斷標準；(2) 能配合進行眼底檢查；(3) 同期的健康體檢者(符合正常糖代謝狀態(tài)并且既往無其他基礎(chǔ)病病史)。排除標準：(1) 糖尿病急性并發(fā)癥(糖尿病酮癥酸中毒，高血糖高滲狀態(tài))；(2) 眼外傷及由其他原因引起的視網(wǎng)膜病變；(3) DR患者已行全視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)；(4) 合并嚴重心、腦及血液等系統(tǒng)疾病及腫瘤；(5) 合并嚴重肝腎功能異常；(6) 合并其他基礎(chǔ)病。本研究獲保定市第一中心醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2方法收集并記錄所有研究對象的年齡(Age)、DM 病程，并測量其身高、體質(zhì)量、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)，計算體質(zhì)量指數(shù) (body mass index，BMI)，BMI=體質(zhì)量/身高2(kg/m2)。所有研究對象均禁食8～10h后次日清晨采集空腹靜脈血(FPG)，以4000r/min 離心5～7min。采用日立7600生化儀器檢驗空腹靜脈血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、甘油三酯(triacylglycerol，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCR)采用糖化HA8180儀器檢驗糖化血紅蛋白(hemoglobin Alc，HbA1c)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清AD(pg/mL)和NEP(U/L)水平，試劑盒購自上海酶聯(lián)免疫生物有限公司(Elabscien)。根據(jù)試劑盒說明書的指示，AD的有效檢測范圍是12.5～400pg/mL，NEP的有效檢測范圍是6.25～200U/L。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，結(jié)合試驗數(shù)據(jù)分析及試劑盒說明書顯示，兩因子批內(nèi)變異系數(shù)均<10%，批間變異系數(shù)均<15%。

2 結(jié)果

2.1四組研究對象基本資料的比較四組研究對象的年齡、DBP比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與NC組相比，DM組、NPDR組、PDR組的BMI顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DM組、NPDR組、PDR組的DM病程差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與NC、DM組相比，NPDR、PDR組的SBP明顯升高，PDR組明顯高于NPDR組(P<0.05)，見表1。

2.2四組研究對象血清生化檢查和相關(guān)指標的比較四組研究對象的TC、BUN、SCR、ALT、AST的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與NC組相比，DM組、NPDR組、PDR組的TG水平明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。四組間的FPG、HbA1c水平依次上升，均以PDR組最高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組間NEP水平依次升高，以PDR組最高(P<0.05)，四組間的AD水平依次降低，其中以PDR組最低(P<0.05)，見表2。

表1 四組研究對象基本資料的比較

注：DM組：單純2型糖尿病組；NPDR組：非增殖期視網(wǎng)膜病變組；PDR組：增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病組；NC組：健康體檢者。

表2 四組研究對象血清生化檢查和相關(guān)指標的比較

注：DM組：單純2型糖尿病組；NPDR組：非增殖期視網(wǎng)膜病變組；PDR組：增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病組；NC組：健康體檢者。

表3 AD、NEP與各指標間的Pearson的相關(guān)分析

2.3血清AD、NEP水平與各相關(guān)因素Pearson相關(guān)分析根據(jù)Pearson相關(guān)分析，血清AD水平與DM病程、SBP、DBP、BMI、TG、FPG、HbA1c、NEP呈負相關(guān)(P<0.05或P<0.01)。血清NEP水平與DM病程、SBP、BMI、TG、FPG、HbA1c呈正相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，與AD呈負相關(guān)(P<0.01)，見表3。

2.4血清AD、NEP水平多元線性回歸分析分別以AD、NEP為因變量，將Pearson相關(guān)分析后得出的差異有統(tǒng)計學意義的指標為自變量，行多元線性逐步回歸分析，結(jié)果顯示血清AD表達的顯著影響因素為FPG、HbA1c和NEP(P<0.05)，顯著影響NEP水平的因素為BMI、FPG、HbA1c和AD(P<0.05或P<0.01)，見表4、5。

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變已經(jīng)成為嚴重影響我國公共健康的主要疾病之一，隨著DR的進展常常造成視力下降、視野缺損、玻璃體積血等損害，嚴重者甚至出現(xiàn)牽拉性視網(wǎng)膜脫離最終導(dǎo)致失明[8-10]。因此對于DR的早期診斷和干預(yù)越來越成為臨床醫(yī)學的研究熱點。本研究旨在以不同分期DR患者為主要研究對象，觀察血清AD和NEP水平在不同分期DR患者中的變化并分析其影響因素，為探究2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生機制提供數(shù)據(jù)支持。

AD是一種由能量平衡相關(guān)基因(enho)編碼的調(diào)節(jié)蛋白，在肝臟和大腦中廣泛表達。有研究顯示，AD可以通過影響磷脂酰肌醇3-激酶-Akt和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶這兩個通路，從而上調(diào)內(nèi)皮NO合成酶的表達，進而增加上皮細胞NO的濃度起到血管內(nèi)皮的保護作用[9]。不僅如此，有動物實驗顯示AD能顯著增加小鼠后肢缺血模型的血流量和毛細血管密度，從而改善機體缺血、缺氧狀態(tài)[11]。同時有研究顯示，AD還可通過降低促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α和白細胞介素6的mRNA表達，減少炎性因子的合成降低血液中炎性因子的濃度，從而減輕內(nèi)皮細胞和單核細胞源性巨噬細胞的炎癥反應(yīng)[12]。眾所周知，代謝的失衡、機體的炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細胞功能障礙、血管通透性增加和新生血管的生成是糖尿病微血管并發(fā)癥的基本過程，同時也是DR(尤其是PDR)的主要發(fā)病機制。上述研究顯示，AD在抑制炎癥反應(yīng)和改善血管內(nèi)皮功能有重要作用，因此我們不難推測AD可能對DR的發(fā)生和發(fā)展也有一定作用。一項觀察不同病程糖尿病患者血清AD水平的研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者血清AD水平明顯低于正常對照組，并且隨著糖尿病病程的延長，AD水平逐漸降低[13]，與本研究測定結(jié)果一致。同時本研究進一步探究了不同時期DR患者血清中AD水平的變化，并分析其影響因素，發(fā)現(xiàn)隨著DR程度的加深血清AD水平逐漸減低，其中以PDR組最低，而且AD水平受到FPG、HbA1c及NEP的負向調(diào)節(jié)，表明AD水平對DR的發(fā)生、發(fā)展起負相關(guān)作用。而且另外一項研究發(fā)現(xiàn)，與DM組相比，PDR組和NPDR組患者血清和玻璃體中AD濃度明顯降低，并且以PDR組最低，表明血清和玻璃體中AD水平與DR進程呈負相關(guān)[14]。不僅如此，本次研究的Pearson的相關(guān)分析還顯示，年齡的增長、肥胖、長期血糖控制不佳和高血脂等因素都可能影響AD的水平。排除其他影響因素后分析得出，F(xiàn)PG、HbA1c、NEP是影響AD水平的獨立影響因素，而且NEP與AD呈明顯的負相關(guān)關(guān)系，表明二者有相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，同時在DR的發(fā)生與發(fā)展中起一定作用。

表4 血清AD水平影響因素的多元線性回歸分析

表5 血清NEP水平影響因素的多元線性回歸分析

NEP是一種位于細胞表面依賴鋅離子的Ⅱ型膜蛋白，在心腦血管和其他組織中廣泛存在[15]。有研究表明，NEP主要通過降解或滅活許多生物活性肽，包括P物質(zhì)、內(nèi)皮素和心房利鈉肽等，從而影響血管內(nèi)皮的功能[16]。而糖尿病患者血管內(nèi)皮功能的改變、新生血管的生成、血管收縮缺氧導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)均為DR發(fā)生和發(fā)展的重要作用機制。另外有研究顯示，可以通過NEP 抑制劑的作用，增加機體利鈉肽的生物利用度，進一步對機體血管內(nèi)皮功能起到調(diào)節(jié)作用[17-18]。而且在一項動物實驗中顯示，與對照組小鼠相比，通過NEP抑制劑處理過的小鼠整體血糖控制水平明顯改善，糖尿病的進程明顯減慢[19]。而且長期的血糖控制不佳和糖尿病病程的延長也是DR發(fā)生發(fā)展的重要因素，故我們可以推測NEP水平與DR的進展程度有相關(guān)性。一項臨床研究顯示，與正常對照組相比，2型糖尿病患者血清中NEP水平明顯升高，而且隨著糖尿病病程的延長，NEP水平逐漸升高，表明NEP水平與糖尿病的發(fā)生有關(guān)。本研究以正常受試者為對照組，測定血清NEP水平的變化，結(jié)果顯示DM組患者血清NEP水平明顯高于NC組，與上述研究結(jié)果一致，同時本研究進一步按照視網(wǎng)膜病變程度進行分組，發(fā)現(xiàn)隨著DR程度的加深，血清NEP水平逐漸升高以PDR組最高，提示NEP水平可能與DR的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系。同時Pearson相關(guān)分析與多元線性回歸分析顯示，BMI、FPG、HbA1c、AD均為NEP水平的重要影響因素，表明NEP可能通過調(diào)節(jié)血糖的控制水平，調(diào)節(jié)機體代謝等作用與AD共同調(diào)節(jié)DR的發(fā)生和進展。

綜上所述，我們通過本次研究發(fā)現(xiàn)，隨著DR嚴重程度的進展，血清AD水平逐漸降低，NEP水平則逐漸升高，并且二者為負相關(guān)關(guān)系，表明AD和NEP可能通過不同的作用機制，以相反的作用方式來參與到DR發(fā)生和發(fā)展中，為以后進一步探究DR的發(fā)生機制提供了數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。然而對于AD和NEP二者間具體的相互作用機制尚未明確，今后將進一步完善相關(guān)的基礎(chǔ)研究，進一步探討AD和NEP的相互影響機制。