玻璃體腔注射抗氧化劑NAC對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用

陳 玲，劉彥芳，林 萍

0 引言

隨著生活水平的提高，糖尿病(diabetes millitus，DM)患者在全世界快速增加。國際糖尿病協(xié)會發(fā)聲，糖尿病的發(fā)展將面臨失控，沒有哪一個國家完全有能力遏制糖尿病的發(fā)展。糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病最為常見和嚴(yán)重的神經(jīng)及微血管并發(fā)癥之一，成為全球性四大主要致盲原因之一[1-2]。前期研究表明，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜有保護(hù)作用[3-4]，其可以抑制糖尿病時(shí)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成增加，下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)在視網(wǎng)膜血管的表達(dá)[4]。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子，在眼部主要由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞合成，在DR的進(jìn)程中作用廣泛。本實(shí)驗(yàn)擬在既往研究的基礎(chǔ)上，觀察抗氧化劑NAC對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層厚度、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量及視網(wǎng)膜中PEDF表達(dá)情況的影響，探討NAC對視網(wǎng)膜保護(hù)作用的機(jī)制，為更早期的DR進(jìn)行有效治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1材料健康成年雄性SD大鼠30只(由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，眼部檢查無異常，體質(zhì)量約180～220g，實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理室內(nèi)有通風(fēng)換氣設(shè)備，保持空氣新鮮，飼料為西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心供應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)飼料。按照隨機(jī)分配的原則分為正常對照組(normal control group，CON組，n=10)和糖尿病組(DM組，n=20)。糖尿病組(DM組)禁食12h后，按照60mg/kg體質(zhì)量劑量一次性左下腹腔注射10g/L鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液，正常對照組(CON組)注入等量的檸檬酸緩沖溶液。用藥72h后，鼠尾靜脈取血檢測血糖，≥16.7mmol/L者定為糖尿病模型動物。成模大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照組(D組，n=8只)和NAC治療組(N組，n=8只)。模型建立后，N組大鼠每周通過玻璃體腔注射4μL 1.6μg/μL的NAC，CON組、D組大鼠則給予玻璃體腔注射4μL 0.01mmol/L的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，不限飲食水，分組喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動物在麻醉下進(jìn)行所有手術(shù)(10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉大鼠)，并盡一切努力最大限度減少其疼痛、痛苦和死亡，符合實(shí)驗(yàn)動物倫理要求。

兔抗大鼠Thy-1.1多克隆抗體檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量，購于北京博奧森，工作濃度1∶50兔抗大鼠PEDF多克隆抗體購于上海研晶生物，工作濃度1∶50；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG購于北京博奧森，工作濃度1∶200。圖像信號采集與分析系統(tǒng)：德國Leica 公司(q550cw);熒光顯微鏡，日本OLYMPAS BX51;熒光圖像采集系統(tǒng)：美國QE SPOT INSIGHT。

1.2方法

1.2.1取材糖尿病大鼠成模2mo后，10%水合氯醛腹腔注射過量麻醉大鼠，迅速摘除眼球，在眼球角膜距角鞏緣0.5mm針刺定位，將眼球固定脫水后常規(guī)包埋，根據(jù)針刺定位點(diǎn)過視神經(jīng)垂直于子午線平面切成5μm厚的切片。

1.2.2 HE及免疫熒光染色每只眼選擇6張切片，每張切片隨機(jī)選取視網(wǎng)膜中央部、中周部、周邊部共5個視野，6張切片測量平均值作為1個樣本。采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改變，并測量內(nèi)核層厚度，并以此作為視網(wǎng)膜組織損傷的判斷指標(biāo)。采用免疫熒光法，按照說明書，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞胞漿為熒光綠。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層厚度各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)核層厚度測定顯示，CON組、D組、N組視網(wǎng)膜內(nèi)核層厚度(32.062±1.543、21.207±3.603、31.187±1.004μm)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.322，P<0.001，圖1)。D組視網(wǎng)膜內(nèi)核層厚度較CON組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，N組視網(wǎng)膜內(nèi)核層厚度較CON組略下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D組視網(wǎng)膜內(nèi)核層厚度較N組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量檢測表明，CON組、D組、N組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量(25.25±4.268、5.13±1.808、23.63±3.159個)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.334，P<0.001，圖2)。D組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量較CON組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；N組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量較CON組略下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量較N組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3免疫熒光法觀察視網(wǎng)膜各層PEDF表達(dá)情況PEDF陽性反應(yīng)主要分布于視網(wǎng)膜內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。糖尿病2mo后，大鼠視網(wǎng)膜中PEDF平均光密度的測定表明，CON組、D組、N組視網(wǎng)膜中PEDF平均光密度值(1.363±0.190、0.688±0.119、1.304±0.218)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.403，P<0.001，圖3)。D組PEDF表達(dá)較CON組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。N組PEDF表達(dá)較CON組略下降，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D組PEDF表達(dá)較N組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

DR是糖尿病最為常見和嚴(yán)重的神經(jīng)及微血管并發(fā)癥之一，也是影響患者生活質(zhì)量的主要原因。PEDF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的新生血管抑制因子[5]，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一種糖蛋白，在眼部主要由視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞合成，1987年Tombrn-Tink等[6]從胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中第一次發(fā)現(xiàn)。Ogata等[7]檢測糖尿病患者玻璃體及房水中PEDF含量較正常人明顯降低，而同時(shí)VEGF含量增加，提示PEDF除了是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子外還可以抑制新生血管的生成。作用機(jī)制主要有：在DR早期通過抑制NADPH氧化酶來發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用[8]；上調(diào)Fasl，促進(jìn)活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等[9]。糖尿病慢性并發(fā)癥的統(tǒng)一機(jī)制學(xué)說認(rèn)為：引起糖尿病各并發(fā)癥的四條經(jīng)典通路,即多元醇通路激活、晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGEs)增加、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活及氨基己糖途徑，實(shí)質(zhì)上都是高糖誘導(dǎo)過氧化物過多表達(dá)的結(jié)果，氧化應(yīng)激是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素[10]。因而抗氧化治療也逐漸被人們所關(guān)注。研究表明，腺病毒介導(dǎo)的PEDF以玻璃體腔注射的方式轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜組織后，視網(wǎng)膜內(nèi)核層較前增厚，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度增高，提示外源性PEDF能夠保護(hù)視神經(jīng)損傷后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷修復(fù),具有神經(jīng)保護(hù)作用[11]。近期也有研究發(fā)現(xiàn)，新型PEDF小肽可以減少脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜新生血管生成[12]。本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病大鼠2mo時(shí)，視網(wǎng)膜內(nèi)核層變薄及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血缺氧可能與視網(wǎng)膜組織中PEDF水平減少有關(guān)。

圖1各組大鼠視網(wǎng)膜組織的形態(tài)學(xué)改變(×400)A：CON組；B：D組；C：N組；GCL；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL：內(nèi)網(wǎng)層；INL；內(nèi)核層;OPL；外網(wǎng)層；ONL：外核層；PEL：色素上皮層。

圖2免疫熒光法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(×400)A：CON組；B：D組；C：N組；圖中箭頭所指為顯色的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的胞膜及樹突。

圖3各組大鼠視網(wǎng)膜中PEDF表達(dá)情況(×400)A：CON組；B：D組；C：N組；圖中箭頭所指為PEDF表達(dá)情況。

NAC是一種含有巰基的抗氧化劑，在以往主要用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，其不但對于呼吸系統(tǒng)疾病起重要作用，同時(shí)在干細(xì)胞保護(hù)及抗腫瘤的過程中也有重要的保護(hù)作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗氧化、減少活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成、清除自由基、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝活性、抗細(xì)胞凋亡等作用[13]。NAC起作用的優(yōu)點(diǎn)有：為小分子物質(zhì),易于進(jìn)入細(xì)胞,脫乙?；蟪蔀楣入赘孰?glutathione,GSH)合成的前體,從而提高組織內(nèi)GSH含量，增加體內(nèi)GSH貯存。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)NAC能提高紅細(xì)胞、肝臟組織和肺組織中細(xì)胞內(nèi)的GSH水平[14]。有研究顯示：抗氧化劑NAC能不同程度恢復(fù)糖尿病大鼠各組織抗氧化水平，從而起到阻止或延緩糖尿病相關(guān)的靶器官功能損害的作用[15]。前期研究發(fā)現(xiàn)，NAC抗氧化應(yīng)激可減輕視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)，從而減輕視網(wǎng)膜新生血管的生成[4]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠2mo時(shí)視網(wǎng)膜中PEDF水平已明顯降低，而通過玻璃體腔注射NAC后視網(wǎng)膜中PEDF水平較D組明顯提高，同時(shí)視網(wǎng)膜組織較D組破壞減少，提示NAC對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織保護(hù)作用，可能是通過NAC的抗氧化應(yīng)激作用，減輕了視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)，從而上調(diào)了視網(wǎng)膜中PEDF水平相關(guān)。

綜上所述，在糖尿病早期，視網(wǎng)膜缺血缺氧的環(huán)境已經(jīng)使PEDF水平下降，抗氧化劑NAC對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織有保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過上調(diào)視網(wǎng)膜中PEDF水平，提示NAC及PEDF有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。