桑色素滴眼液治療圍絕經(jīng)期雌性兔干眼的實驗研究

江 威，葛倩敏，黎 彪，袁 晴，梁榮斌，李秋玉，朱佩文，鄧軍萍，石文卿，邵 毅

0 引言

干眼(dry eye disease,DED)是眼表面多因子疾病，其可致使淚液滲透壓增高和淚膜不穩(wěn)定，眼表炎癥和損傷以及神經(jīng)感覺異常為其主要特征[1]，中、重度的DED可使患者生活質(zhì)量下降，甚至產(chǎn)生一定的心理問題。近年來的研究表明，按照不同的標準，DED的總體發(fā)病率8.7%～30.1%[2-5]。雄激素可作用于淚腺，因此淚腺是其靶器官之一，淚腺的結(jié)構(gòu)和功能，包括其細胞結(jié)構(gòu)、基因表達、免疫活性等在雄激素的作用下可發(fā)生相當大的改變[6]。而雄激素缺乏則可能導(dǎo)致淚腺功能障礙或淚液缺乏，從而引起干眼[7]。針對因雄激素水平改變而導(dǎo)致干眼的患者進行了激素治療的臨床研究，但為減少副作用，目前的治療仍以局部對癥治療為主。因此，目前較好地解決方案是探尋此前未曾使用的激素替代藥物。糖可與絕大多數(shù)黃酮類化合物結(jié)合形成苷，并保存在植物的根、葉和果實里，其余的黃酮類化合物則以游離形式存在，具有多種生物活性，如抗炎、抗氧化、抗免疫及抗癌等作用[8]。桑色素(morin)則是其中一種，可從?？浦参镏刑崛。ㄟ^雄激素受體結(jié)合，一定程度上發(fā)揮彌補雄激素不足的作用。本實驗應(yīng)用圍絕經(jīng)期雌兔造模，探究桑色素滴眼劑對干眼的治療效果，為日后臨床雄激素替代治療提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料從南昌大學(xué)動物實驗室中選取6周齡的新西蘭雌性白兔36只，要求所選雌兔體質(zhì)量均為2.0～2.5kg。對所選取的雌兔的眼前節(jié)及眼底使用眼底鏡、裂隙燈顯微鏡進行檢查，SⅠt≥10mm/5min。本實驗經(jīng)倫理委員會審批，符合動物實驗的相關(guān)準則。

1.2方法

1.2.1圍絕經(jīng)期雌兔干眼模型的構(gòu)建參照文獻[9]，隨機選取36只雌兔，稱重。腹腔注射足量的3%氨基甲酸乙酯溶液(45mg/kg)，然后將雌兔仰臥位放置，將頭部及四肢固定并充分暴露其腹部，并使用電動剃刀對下腹部備皮。在使用碘伏對暴露的腹部進行消毒后，鋪無菌巾單，無菌操作，并將手術(shù)刀經(jīng)腹正中切口逐層剖入腹腔，行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(orchiectomized，ORX)，然后依次關(guān)閉各層腹壁，連續(xù)縫合皮膚。術(shù)后連續(xù)3d行抗感染治療，給予雌兔肌肉注射青霉素，并局部擦拭碘伏消毒。經(jīng)過2mo觀察后,被選取的雌兔角膜干燥且缺乏光澤,熒光素染色可見散布的點狀潰瘍，SⅠt<10mm/5min，淚膜破裂時間<12s。

1.2.2分組及處理將ORX術(shù)后2mo成功建模的24只雌兔隨機分為對照組、實驗組兩組(每組為12只，且都選取右眼進行處理)：(1)對照組：對照磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)組；(2)實驗組：桑色素組。對對照組和實驗組雌性兔右眼連續(xù)滴眼6wk，4次/d。在治療前、治療后2、4、6wk時，分別對對照組和實驗組雌性兔進行角膜淚液蛋白測定、角膜共聚焦顯微鏡檢查、SⅠt檢查及熒光素染色檢測。

1.2.3實驗動物造模及篩選標準為控制變量，24只雌兔全部由相同的操作者檢查,以保證每次檢查選取同一時間地點，且控制照明亮度不變，濕度和溫度每次相同。經(jīng)過2mo觀察后,被選取的雌兔角膜干燥且缺乏光澤,熒光素染色可見散布的點狀潰瘍，SⅠt<10mm/5min，淚膜破裂時間<12s。

1.2.4桑色素提取液的制備

1.2.4.1提取根據(jù)參考文獻[10]，將干燥?？浦参飿淙~碾碎，取碾碎后的粉末20g，置于具塞三角燒瓶中，然后將8倍量(體積分數(shù)70%)乙醇加入燒瓶中，搖勻后在室溫下放置10h后，經(jīng)過20min超聲提取，過濾后再次將6倍量乙醇加入，再經(jīng)5min超聲提取后，過濾；準備一根離心管,將兩次乙醇提取液一起加入其中，離心(2000r/min)，最后提取上清液。分別用1L乙酸乙酯和氯仿萃取，得到萃取液，使用HPLC-CL法檢測桑色素含量。

1.2.4.2分離純化用80～100目聚酰胺柱色譜法層析分離萃取液，分離完成后用70%乙醇洗脫。洗脫液以柱體積為單位進行濃度檢測，重復(fù)上述純化步驟直至得到較高純度(>95%)的桑色素提取液[11]。

1.2.5桑色素滴眼劑的制備桑色素滴眼劑制備步驟：(1)溶解：提取物質(zhì)量∶水比為0.1∶1.0；(2)加入眼潤滑劑羧甲基纖維素(1.5g/L)；(3)緩沖：NaHCO3，KCl(0.1g/L以下)；(4)檢測并調(diào)整理化特性：表面張力(40～50dyn/cm2)、屈光指數(shù)(1.336)、比重(約等于1)、滲透壓(311～350mOsm)、黏稠度(略高于水)和pH值(7.3～7.8)；(5)加入保存劑：苯扎溴銨(0.05g/L)。

1.2.6 PBS滴眼劑的制備PBS滴眼劑制備步驟：(1)配制PBS緩沖液：磷酸二氫鉀(KH2PO4)：0.27g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：1.42g，氯化鈉(NaCl)：8g，氯化鉀(KCl)：0.2g，加去離子水大約800mL將其混勻并且使固體完全溶解，再緩慢加濃鹽酸直至調(diào)節(jié)酸堿度為7.4，最后定容到1L；(2)加入眼潤滑劑羧甲基纖維素(1.5g/L)；(3)檢測并調(diào)整理化特性：調(diào)至與桑色素滴眼劑相似；(4)加入保存劑：苯扎溴銨(0.05g/L)。

表1 兩組治療前后SⅠt及FL評分比較

注：aP<0.05vs對照組；cP<0.05vs治療前。

1.2.7角膜熒光素染色及SⅠt檢測角膜熒光素染色：使用10g/L熒光素鈉點眼1滴后使雌兔立即瞬目，參照評分系統(tǒng)進行評分并分級[12]：0級：無染色；1級：很少的播散性污漬染色；2級：中度污漬染色，程度在1～3級間；3級：重度融合性污漬染色。

SⅠt檢查淚液基礎(chǔ)分泌情況。取出刻度濾紙并將其一邊折疊，置于待檢查雌兔眼下結(jié)膜囊的中外1/3處5min，并在取出試紙后測量其被浸潤長度。參照文獻[13]，SⅠt≥10mm/5min為正常。為控制變量，所有操作均由同一人完成。

1.2.8淚液蛋白測定從9∶00到11∶00取淚液樣品，在淚河處取20μL無刺激性淚液，并儲存在-80℃的冰箱保存。使用小牛血清白蛋白作為標準，通過Brandford方法測量淚液的總蛋白質(zhì)含量。淀粉酶活性測定參照文獻[14]：操作采用自動分析儀分析(LX20；Beckman，F(xiàn)ullerton，CA)，4,6-亞乙基-對硝基苯-α-D-麥芽七糖苷(ethylidene-4-nitrophenyl-α-d-maltoheptaoside，Leadman Group Co，Ltd.，Beijing，China)作為底物。

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)測定參照文獻[15]：從冰箱中取出10μL事先儲存的淚液樣品，稀釋淚液樣品，繪制出標準曲線并計算LF含量。通過比濁法測算溶菌酶含量，并參照說明書制作標準曲線、使用溶菌酶測試試劑盒，配制溶菌酶標準液和制備染色菌液;最后,把淚液樣品和染色菌液混合搖勻，然后將混合液離心，獲取上清液，淚液樣品中溶菌酶含量可根據(jù)樣品與測定管對照管光密度相差的數(shù)值，參照標準曲線計算出。

1.2.9共聚焦顯微鏡檢查使用共聚焦顯微鏡對各組雌兔被測眼的角膜上皮的變化情況進行觀察，由同一人實施檢查。檢查步驟：使雌兔頭部固定，無法搖晃，讓雌兔的眼睛直視前方，以5g/L的鹽酸丙美卡因滴眼液點眼后，對中央角膜行全層檢查，并保存清晰有效的圖片，使用計算機軟件測算炎癥細胞和角膜上皮基底細胞的密度。神經(jīng)密度(mm/mm2)：觀察角膜下神經(jīng)叢，采取35～50μm觀察深度。應(yīng)用AUTOCAD軟件(Auto Desk Co.，Ltd,CA,US)確定角膜下神經(jīng)纖維的長度。按實際角膜面積0.16mm2(400×400μm)/幀的標準獲取每個圖像，并描繪出觀察到的單個圖像中的神經(jīng)纖維形狀(圖1，引自文獻[16])，通過所描繪的折線特征得出折線的總長，然后將所得的折線總長比上面積的大小(0.16mm2)以計算出神經(jīng)纖維密度(mm/mm2)。神經(jīng)纖維分支:為每個圖像中看到的總分支數(shù)。曲率評分：圖像中神經(jīng)纖維曲率的程度可分為4個等級。分數(shù)越高，則神經(jīng)纖維曲率越高[14]。

2 結(jié)果

2.1兩組治療前后干眼相關(guān)指標比較治療前，治療后2、4、6wk，兩組SⅠt比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=9.92，F(xiàn)時間=10.16，F(xiàn)組間×?xí)r間=13.54，均P<0.05)。治療前兩組SⅠt相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.643，P>0.05)；與治療前相比較，治療2、4、6wk時實驗組的SⅠt都產(chǎn)生了程度不一的改善，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.752，t=6.714，t=9.315，均P<0.05)，而對照組SⅠt較治療前明顯惡化，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.842，t=5.825，t=5.648，均P<0.05)；兩組治療2、4、6wk時SⅠt比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.436、6.763、11.658，均P<0.05)。治療前，治療后2、4、6wk，兩組FL比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=8.12，F(xiàn)時間=9.28，F(xiàn)組間×?xí)r間=15.14，均P<0.05)。治療前兩組FL評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.526，P>0.05)；與治療前相比，治療2、4、6wk實驗組FL評分均產(chǎn)生不同程度改善，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.763、5.653、3.542，均P<0.05)，對照組與治療前比較，F(xiàn)L評分則明顯惡化，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.763、7.652、8.541，均P<0.05)；兩組治療2、4、6wk時FL評分比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.873、7.762、9.065，均P<0.05),見表1。

2.2兩組治療前后淚液蛋白比較治療前，治療后2、4、6wk兩組溶菌酶含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=12.38，F(xiàn)時間=10.72，F(xiàn)組間×?xí)r間=17.27，均P<0.05)。治療前，治療后2、4、6wk兩組乳鐵蛋白比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=10.93，F(xiàn)時間=11.23，F(xiàn)組間×?xí)r間=20.83，均P<0.05)。治療前，治療后2、4、6wk兩組淀粉酶活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=11.78，F(xiàn)時間=14.95，F(xiàn)組間×?xí)r間=18.23，均P<0.05)。治療前，治療后2、4、6wk兩組淚液總蛋白量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=9.43，F(xiàn)時間=10.43，F(xiàn)組間×?xí)r間=17.65，均P<0.05)，見表2。

治療前兩組溶菌酶含量、乳鐵蛋白、淀粉酶活性和淚液總蛋白量無顯著差別，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.425、9.532、9.672、5.267，均P>0.05)；經(jīng)過6wk的桑色素處理，實驗組溶菌酶含量、乳鐵蛋白、淀粉酶活性和淚液總蛋白量與治療前相比沒有顯著變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.732、8.541、7.542、10.764，均P>0.05)；而對照組在6wk PBS處理后與治療前相比，溶菌酶含量、乳鐵蛋白、淀粉酶活性和淚液總蛋白量都發(fā)生程度不一的降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.426、0.512、0.633、0.594，均P<0.05)；治療2、4、6wk后兩組溶菌酶含量、乳鐵蛋白、淀粉酶活性和淚液總蛋白量相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

圖1共聚焦顯微鏡下神經(jīng)纖維形態(tài)A:AUTOCAD截取的共聚焦顯微圖像內(nèi)的神經(jīng)纖維；B:根據(jù)神經(jīng)纖維描繪的折線。

圖2兩組雌性兔的角膜上皮下基底細胞圖片A：對照組治療前；B：對照組治療6wk后；C：實驗組治療前；D：實驗組治療6wk后。

表2 治療前后不同時間兩組雌兔淚液蛋白比較

注：aP<0.05vs對照組；cP<0.05vs治療前。

2.3兩組治療前后共聚焦顯微鏡觀察圖像分析治療前可觀察到角膜上皮基底細胞的邊界較窄，可見光亮炎性細胞(圖2A)。對照組治療前、治療后6wk，可觀察到上皮基底細胞的密度顯著增大，且上皮基底層觀察到呈現(xiàn)為亮光樣的炎性細胞(圖2A、B)；而實驗組在治療前可觀察到呈現(xiàn)為亮光樣的炎性細胞(圖2C)，但經(jīng)6wk治療后，炎性細胞的數(shù)目顯著減少，而和正常雌性兔相比，上皮基底細胞的密度則略有下降(圖2D)。經(jīng)6wk治療后，對照組炎癥細胞密度為321±91個/mm2，上皮基底細胞密度為4436±289個/mm2，而實驗組炎癥細胞密度為36±11個/mm2，上皮基底細胞密度為3219±223個/mm2，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.477、5.246，均P<0.05)。

對照組角膜的上皮下神經(jīng)相對平直，并且較多(圖3A)，6wk后其密度較治療前減小，并可觀察到多支神經(jīng)纖維發(fā)生明顯彎曲(圖3B)。實驗組角膜上皮下神經(jīng)可見明顯彎曲及分支(圖3C)，治療6wk后，其密度較治療前增加，彎曲度明顯減小(圖3D)。

治療前，治療后2、4、6wk兩組神經(jīng)纖維密度相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=15.22，F(xiàn)時間=14.51，F(xiàn)組間×?xí)r間=18.73，均P<0.05)。治療前，治療后2、4、6wk兩組神經(jīng)纖維分支相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=7.53，F(xiàn)時間=8.77，F(xiàn)組間×?xí)r間=10.24，均P<0.05)。治療前，治療后2、4、6wk兩組神經(jīng)纖維曲率評分相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=9.43，F(xiàn)時間=8.45，F(xiàn)組間×?xí)r間=12.84，均P<0.05)。

治療前兩組角膜上皮下神經(jīng)比較，其密度大小、曲率評分、分支多少均未表現(xiàn)出明顯差別，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療6wk后，對照組角膜上皮下神經(jīng)的曲率評分、分支多少和密度大小較治療前明顯改變，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組和治療前相比，實驗組神經(jīng)纖維曲率評分降低，分支數(shù)量顯著減少，神經(jīng)纖維密度增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

3 討論

目前干眼癥的發(fā)病人群正逐步朝著低齡化轉(zhuǎn)變，但缺乏雄激素可以導(dǎo)致DED的發(fā)生，已有研究證明，雄激素在調(diào)節(jié)眼表和附屬器官的過程中發(fā)揮了很大的作用[17]。其效應(yīng)具有分子生物學(xué)基礎(chǔ)，其調(diào)節(jié)涉及淚腺基因的表達[18]。受睪酮影響最大的基因包括與細胞生長，增殖和代謝，細胞通訊和運輸，核酸結(jié)合，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和受體活性相關(guān)的基因[18]。且雄激素的一些作用針對有絲分裂周期和DNA代謝的調(diào)節(jié)，這些反應(yīng)可能可以促進上皮細胞增殖[19]。

干眼造模完成后，淚腺的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能遭受明顯損害，其改變包括退行性改變，如生長和活動減少，腺體成分丟失，腺泡細胞大小減少，核體積和多態(tài)性減少，結(jié)締組織增生，蛋白質(zhì)水平中斷，酶活性改變等[20]。同時，研究人員也報道，雄激素替代療法可以逆轉(zhuǎn)造模產(chǎn)生的影響，并可能引起組織結(jié)構(gòu)，細胞活性和腺體分泌發(fā)生變化。這些改變可能包括腺泡上皮細胞活動活躍，出現(xiàn)豐富的糖蛋白分泌細胞，腺泡的增大，黏液和高度聚合的碳水化合物的生成，炎癥的抑制以及淚液蛋白和液體分泌的變化[21-22]。因此，雄激素替代療法在對因治療上是較為有效的選擇，但長期的激素應(yīng)用有著嚴重的副作用，所以迫切需要尋找某種療效佳且副作用相對較小的雄激素替代藥物。

圖3兩組雌性兔角膜上皮下神經(jīng)的圖像A：對照組治療前；B：對照組治療6wk后；C：實驗組治療前；D：實驗組治療6wk后。

表3 兩組雌兔治療后角膜上皮下神經(jīng)情況比較

注：aP<0.05vs對照組；cP<0.05vs治療前。

黃酮類物質(zhì)可以發(fā)揮擬雄激素的作用，有望作為雄激素替代藥物，在一定程度上減輕雄激素減少帶來的副作用[23]。桑色素可以從一些中草藥以及?？浦参镏刑崛～@得，利用它與雄激素化學(xué)構(gòu)型的相似性，與細胞膜雄激素受體結(jié)合發(fā)揮擬雄激素作用，通過對角膜、細胞凋亡和淚腺局部炎癥反應(yīng)產(chǎn)生影響從而達到治療干眼癥的目的。本實驗研究結(jié)果表明，實驗組在經(jīng)過桑色素滴眼液處理后，其SⅠt明顯增加，F(xiàn)L評分明顯下降，并且溶菌酶含量、乳鐵蛋白、淀粉酶活性和淚液總蛋白含量則仍可與治療前保持相似的水平，而對照組的上述各項指標相較未處理時則顯著變差，這意味著造模后的雌兔在經(jīng)過桑色素滴眼液的處理后，其干眼癥狀在很大程度上得到了緩解。我們推測，這一作用可能是由于作為黃酮類物質(zhì)的桑色素增加了淚腺組織的TGF-β1的表達，減少了IL-1β和TNF-α的表達，從而緩解了淚腺局部炎癥反應(yīng)。同時，通過應(yīng)用桑色素，淚腺組織中bcl-2 mRNA的表達得以提高，最終抑制淚腺組織的細胞凋亡。并且，桑色素可能發(fā)揮了和雄激素類似的作用，調(diào)節(jié)了淚腺一些蛋白質(zhì)的分泌量，并在某種程度上減少了MHC Ⅱ類抗原處理基因的淚腺表達，以及ASGPR1的表達[24]。

綜上所述，桑色素滴眼液在一定程度上對消除圍絕經(jīng)期雌兔干眼的癥狀和維持淚液蛋白成分有一定作用，而且由于其給藥方便，副反應(yīng)較少，致使在未來臨床應(yīng)用中患者可能具有較高的依從性，因此具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。但是，對于桑色素滴眼液的臨床應(yīng)用，還需進一步的試驗和驗證。