密蒙花滴眼液對(duì)去勢(shì)雄兔干眼結(jié)膜炎性因子IL-1β和黏蛋白5AC及P38MAPK表達(dá)的影響

彭曉芳，彭清華，彭 俊，周亞莎，張又瑋，覃艮艷

0 引言

干眼是一種常見(jiàn)的眼表疾病，其病因復(fù)雜，尚無(wú)明確的病因，臨床病程發(fā)展緩慢[1]，干眼發(fā)病率極高[2]，是近年眼科的研究重點(diǎn)、熱點(diǎn)及難點(diǎn)。臨床實(shí)踐中，對(duì)于干眼的認(rèn)識(shí)不斷深入，2017年TFOS DEWS Ⅱ?qū)Ω裳鄣亩x進(jìn)行了修改，干眼的新定義為:眼表的一種多因子疾病，特征是淚膜穩(wěn)態(tài)的喪失并伴有眼表癥狀，其病因包括淚膜不穩(wěn)定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷和神經(jīng)感覺(jué)異常[3]。目前干眼現(xiàn)有的治療方法并不理想，各類(lèi)西藥均有各自的局限性，療效不滿(mǎn)意，甚至造成許多副作用[4-5]。

密蒙花是中國(guó)藥典收載藥品，也是眼科臨床常用中藥[6]。密蒙花有效成分為黃酮。我們基于中醫(yī)古籍理論支持以及大量臨床觀察，制備了自制藥物密蒙花滴眼液治療干眼，并進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)研究。前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，密蒙花可以抑制淚腺細(xì)胞的凋亡[7-8]、顯著調(diào)節(jié)淚腺局部炎癥反應(yīng)，參與抗干眼[9-10]。但密蒙花滴眼液對(duì)結(jié)膜炎性因子表達(dá)、淚膜穩(wěn)定性的影響尚無(wú)研究。

故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)雄兔行雙側(cè)睪丸、附睪切除術(shù)，成功建立干眼模型后，使用不同濃度的密蒙花滴眼液對(duì)雄兔進(jìn)行治療，觀察其對(duì)去勢(shì)導(dǎo)致干眼雄兔結(jié)膜局部炎性因子IL-1β、黏蛋白5AC(MUC5AC)及P38MAPK表達(dá)的影響，從這些方面來(lái)評(píng)價(jià)密蒙花滴眼液對(duì)于干眼的療效，從而為中醫(yī)藥治療干眼提供現(xiàn)代理論依據(jù)和新的治療方法。

1 材料和方法

1.1材料選取健康成年，無(wú)全身疾患的新西蘭長(zhǎng)耳大白兔36只，雄性，體質(zhì)量1.5～2.0kg，湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)前行常規(guī)眼科檢查(裂隙燈、眼底鏡)，排除內(nèi)外疾患方進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。密蒙花總黃酮和總苯丙素提取物由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院藥劑科從密蒙花中提??；密蒙花不同濃度滴眼液由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備；丙酸睪酮注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司)；注射用青霉素鈉(廣州白云山天心制藥股份有限公司)；3%H2O2去離子水(中杉金橋)；磷酸鹽緩沖液、25%烏拉坦(湖南福滋堂生物公司)；熒光素鈉眼科檢測(cè)試紙(天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；DAB顯色劑(重慶生物技術(shù)有限公司)。本實(shí)驗(yàn)得到湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

1.2方法將36只健康成年雄兔按照隨機(jī)排列表法分成6組，每組6只，空白組、模型組、密蒙花滴眼液低濃度組(1mg/mL)、中濃度組(1.5mg/mL)、高濃度組(3mg/mL)、睪酮組。除了空白組外，其余組均參照馬軼群等[11]的方法，行雙側(cè)睪丸切除術(shù)(ORX)，將模型組、密蒙花滴眼液低濃度組(1mg/mL)、中濃度組(1.5mg/mL)、高濃度組(3mg/mL)、睪酮組五組實(shí)驗(yàn)兔以25%烏拉坦注射液0.4mL/100mg耳緣靜脈麻醉，雄兔取仰臥位，四肢張開(kāi)并固定，下腹部褪毛劑褪毛，陰囊皮下加用2%利多卡因局部麻醉，碘伏消毒，鋪無(wú)菌巾單，將一側(cè)辜丸由腹腔擠入陰囊并捏緊。用消毒刀片將陰囊切一小口，用力擠出睪丸，結(jié)扎精索靜脈及輸精管，切除睪丸及附睪，連續(xù)縫合陰囊皮膚后局部涂碘酊預(yù)防感染。另側(cè)睪丸及附睪同法切除。術(shù)中靜脈滴注生理鹽水100mL，內(nèi)加青霉素40萬(wàn)U，術(shù)后連續(xù)3d肌肉注射青霉素針40萬(wàn)U，預(yù)防感染。造模8wk后檢查模型。各組動(dòng)物均由同一人檢查，各組動(dòng)物每次檢查時(shí)間、地點(diǎn)、照明溫度、濕度及亮度相同。模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)：檢查干眼模型兔見(jiàn)角結(jié)膜外觀干燥，淚液量少，SchirmerⅠ試驗(yàn)值(SⅠt)均<10mm/5min(空白組均>10mm/5min)；BUT均<10s；熒光素染色見(jiàn)角結(jié)膜點(diǎn)、片狀著色。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，密蒙花滴眼液中濃度組及睪酮組各死亡1只。其余兔造模成功后，空白組和模型組不予以處理，密蒙花滴眼液低濃度組(1mg/mL)、中濃度組(1.5mg/mL)、高濃度組(3mg/mL)給予密蒙花不同濃度滴眼液，3次/d，睪酮組按0.5mL/kg劑量在大腿肌肉處注射丙酸睪酮，每3d 1次，用藥時(shí)間為4wk。常規(guī)喂養(yǎng)。各組分別于造模前及用藥4wk后，用25%烏拉坦全身麻醉后，對(duì)兔子進(jìn)行SchirmerⅠ試驗(yàn)、BUT及角膜熒光素染色檢測(cè)。用藥后4wk當(dāng)天不予以治療，全身麻醉下以空氣栓塞法處死，即刻取出球結(jié)膜，放入多聚甲醛中固定24h，常規(guī)石蠟包埋切片，采用免疫組織化學(xué)方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)IL-1β、MUC5AC、P38MAPK。

表1 各組兔造模前和用藥4wk后SⅠt值比較

注：低濃度組為密蒙花滴眼液1mg/mL；中濃度組為密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高濃度組為密蒙花滴眼液3mg/mL。

2 結(jié)果

2.1各組兔造模前和用藥4wk后SⅠt值比較造模前各組SⅠt值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.64，P>0.05)。空白組、密蒙花滴眼液中濃度組、高濃度組、睪酮組自身前后對(duì)比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，密蒙花滴眼液低濃度組和模型組自身前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。用藥4wk后,各組之間SⅠt值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.94，P<0.01)，模型組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t模型組vs空白組=12.65，P模型組vs空白組<0.01；t模型組vs低濃度組=5.14，P模型組vs低濃度組<0.01；t模型組vs中濃度組=9.09，P模型組vs中濃度組<0.01；t模型組vs高濃度組=9.55，P模型組vs高濃度組<0.01；t模型組vs睪酮組=7.18，P模型組vs睪酮組<0.01)，密蒙花滴眼液低濃度組與中濃度組、高濃度組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t低濃度組vs中濃度組=3.95，P低濃度組vs中濃度組<0.05；t低濃度組vs高濃度組=4.41，P低濃度組vs高濃度組<0.05；)，但密蒙花滴眼液中濃度組與高濃度組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t中濃度組vs高濃度組=0.46，P中濃度組vs高濃度組>0.05)，見(jiàn)表1。

表2 各組雄兔用藥4wk后角膜熒光素染色情況比較 眼

注：低濃度組為密蒙花滴眼液1mg/mL；中濃度組為密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高濃度組為密蒙花滴眼液3mg/mL。

2.2各組兔用藥4wk后角膜熒光素染色情況比較造模前，各組大鼠角膜均透明、潤(rùn)澤，熒光素染色陰性；造模成功用藥4wk后，模型組、密蒙花滴眼液各濃度組、睪酮組均有著染，其中，模型組著染最明顯。對(duì)各組大鼠角膜熒光素染色情況采用Kruskal-WallishH檢驗(yàn)方法，結(jié)果顯示各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=45.314，P<0.01)，見(jiàn)表2。

2.3各組兔造模前和用藥4wk后BUT值比較造模前各組BUT值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.60，P<0.01)，空白組、密蒙花滴眼液各濃度組及睪酮組自身前后對(duì)比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組自身前后比較，BUT值明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。用藥4wk后，各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.91，P<0.01)。模型組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t模型組vs空白組=10.51，P模型組vs空白組<0.05；t模型組vs低濃度組=6.31，P模型組vs低濃度組<0.01；t模型組vs中濃度組=8.74，P模型組vs中濃度組<0.01；t模型組vs高濃度組=9.06，P模型組vs高濃度組<0.01；t模型組vs睪酮組=11.04，P模型組vs睪酮組<0.01)。密蒙花滴眼液低濃度組與中濃度組、高濃度組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t低濃度組vs中濃度組=2.42，P低濃度組vs中濃度組<0.05；t低濃度組vs高濃度組=2.51，P低濃度組vs高濃度組<0.05)，但密蒙花滴眼液中濃度組與高濃度組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t中濃度組vs高濃度組=1.21，P中濃度組vs高濃度組<0.05)。密蒙花高濃度組與睪酮組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t高濃度組vs睪酮組=2.31，P高濃度組vs睪酮組<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4免疫組織化學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為定性資料，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.1各組兔用藥4wk后IL-1β水平比較各組兔用藥4wk后IL-1β水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.731，P<0.01)。模型組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t模型組vs空白組=16.18，P模型組vs空白組<0.01；t模型組vs低濃度組=7.64，P模型組vs低濃度組<0.01；t模型組vs中濃度組=10.18，P模型組vs中濃度組<0.01；t模型組vs高濃度組=10.27，P模型組vs高濃度組<0.01；t模型組vs睪酮組=12.36，P模型組vs睪酮組<0.01)；密蒙花滴眼液低濃度組與中濃度組、高濃度組、睪酮組比較，IL-1β表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t低濃度組vs中濃度組=2.55，P低濃度組vs中濃度組<0.05；t低濃度組vs高濃度組=2.64，P低濃度組vs高濃度組<0.05；t低濃度組vs睪酮組=4.73，P低濃度組vs睪酮組<0.05)；密蒙花滴眼液中濃度組和高濃度組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.09，P>0.05)；密蒙花滴眼液高濃度組與睪酮組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.09，P<0.05),見(jiàn)表4及圖1。

2.4.2各組兔用藥4wk后MUC5AC水平比較各組兔用藥4wk后MUC5AC水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.098，P<0.01)。模型組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t模型組vs空白組=14.79，P模型組vs空白組<0.01；t模型組vs低濃度組=4.93，P模型組vs低濃度組<0.01；t模型組vs中濃度組=8.09，P模型組vs中濃度組<0.01；t模型組vs高濃度組=8.45，P模型組vs高濃度組<0.01；t模型組vs睪酮組=9.18，P模型組vs睪酮組<0.01)；密蒙花滴眼液低濃度組與中濃度組、高濃度組、睪酮組比較，陽(yáng)性表達(dá)減少，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t低濃度組vs中濃度組=3.16，P低濃度組vs中濃度組<0.05；t低濃度組vs高濃度組=3.52，P低濃度組vs高濃度組<0.05；t低濃度組vs睪酮組=4.28，P低濃度組vs睪酮組<0.05)；密蒙花滴眼液中濃度組和高濃度組、睪酮組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t中濃度組vs高濃度組=0.36，P中濃度組vs高濃度組>0.05；t中濃度組vs睪酮組=1.09，P中濃度組vs睪酮組>0.05)；密蒙花滴眼液高濃度組與睪酮組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.73，P>0.05)，見(jiàn)表4及圖2。

圖1用藥4wk后免疫組化觀察IL-1β的表達(dá)(×400)A：空白組結(jié)膜上皮細(xì)胞中可見(jiàn)極少量IL-1β陽(yáng)性表達(dá);B：模型組結(jié)膜上皮可見(jiàn)大量棕黃色顆粒沉著，陽(yáng)性表達(dá)明顯增多;C:密蒙花滴眼液低濃度組結(jié)膜上皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)較空白組增多，但較模型組少;D:密蒙花滴眼液中濃度組結(jié)膜上皮細(xì)胞可見(jiàn)少量IL-1β陽(yáng)性表達(dá)，但較模型組明顯減少;E:密蒙花滴眼液高濃度組結(jié)膜上皮細(xì)胞中可見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)，較模型組明顯減少;F:睪酮組結(jié)膜上皮細(xì)胞中可見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)，較密蒙花滴眼液高濃度少。

表3 各組兔造模前和用藥4wk后BUT比較

注：低濃度組為密蒙花滴眼液1mg/mL；中濃度組為密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高濃度組為密蒙花滴眼液3mg/mL。

表4 用藥4wk后各組兔結(jié)膜細(xì)胞中IL-1β和MUC5AC及P38MAPK平均光密度值

注：低濃度組為密蒙花滴眼液1mg/mL；中濃度組為密蒙花滴眼液1.5mg/mL；高濃度組為密蒙花滴眼液3mg/mL。

圖2用藥4wk后免疫組化觀察MUC5AC的表達(dá)(×400)A：空白組結(jié)膜上皮細(xì)胞中可見(jiàn)大量MUC5AC陽(yáng)性表達(dá)，高于其它各組;B：模型組結(jié)膜上皮可見(jiàn)極少量MUC5AC，陽(yáng)性表達(dá)明顯減少;C：密蒙花滴眼液低濃度組結(jié)膜上皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)較空白組少，但較模型組多;D：密蒙花滴眼液中濃度組結(jié)膜上皮細(xì)胞可見(jiàn)較多陽(yáng)性表達(dá)，較模型組明顯增多;E：密蒙花滴眼液高濃度組結(jié)膜上皮細(xì)胞中可見(jiàn)較多陽(yáng)性表達(dá)，較模型組明顯增多;F：睪酮組結(jié)膜上皮細(xì)胞中可見(jiàn)大量陽(yáng)性表達(dá)。

圖3用藥4wk后免疫組化觀察P38MAPK的表達(dá)(×400)A：空白組結(jié)膜上皮細(xì)胞中可見(jiàn)極少量P38MAPK陽(yáng)性表達(dá);B：模型組結(jié)膜上皮可見(jiàn)大量棕黃色顆粒沉著，陽(yáng)性表達(dá)明顯增多(箭頭示);C：密蒙花滴眼液低濃度組結(jié)膜上皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)較空白組增多，但較模型組少;D：密蒙花滴眼液中濃度組結(jié)膜上皮細(xì)胞可見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)，但較模型組明顯減少;E：密蒙花滴眼液高濃度組結(jié)膜上皮細(xì)胞中可見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)，較模型組明顯減少;F：睪酮組結(jié)膜上皮細(xì)胞中可見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)，較高濃度少。

2.4.3各組兔用藥4wk后P38MAPK水平比較各組兔用藥4wk后P38MAPK水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=162.058，P<0.01)。模型組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t模型組vs空白組=27.24，P模型組vs空白組<0.01；t模型組vs低濃度組=9.65，P模型組vs低濃度組<0.01；t模型組vs中濃度組=13.91，P模型組vs中濃度組<0.01；t模型組vs高濃度組=14.40，P模型組vs高濃度組<0.01；t模型組vs睪酮組=17.87，P模型組vs睪酮組<0.01)；密蒙花滴眼液低濃度組用藥4wk后P38MAPK水平與中濃度組、高濃度組、睪酮組比較，陽(yáng)性表達(dá)增加，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t低濃度組vs中濃度組=4.26，P低濃度組vs中濃度組<0.05；t低濃度組vs高濃度組=4.75，P低濃度組vs高濃度組<0.05；t低濃度組vs睪酮組=8.22，P低濃度組vs睪酮組<0.05)；密蒙花滴眼液中濃度組和高濃度組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.48，P>0.05)；密蒙花滴眼液中濃度組與睪酮組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.22，P<0.05)；密蒙花滴眼液高濃度組與睪酮組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.47，P<0.05)，見(jiàn)表4和圖3。

3 討論

目前干眼的病因尚未明確，干眼的致病因素多而復(fù)雜，包括有眼表炎癥、性激素失衡、神經(jīng)機(jī)能障礙、維生素A缺乏和免疫功能紊等，其中，炎癥在干眼發(fā)病機(jī)制中的重要性已得到充分證明。多種炎癥因子通過(guò)交互構(gòu)成的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，使眼表組織炎癥反應(yīng)加重。2017年TFOS DEWS Ⅱ在生物性別、社會(huì)性別及激素報(bào)告中詳細(xì)論述了性激素(如雄激素和雌激素)、下丘腦-垂體激素、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子1、糖皮質(zhì)激素和甲狀腺激素對(duì)性別相關(guān)的眼部差異的影響，其中性激素的作用尤為重要[12-13]。本實(shí)驗(yàn)以此為依據(jù)，通過(guò)免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，去勢(shì)雄兔干眼模型組結(jié)膜中可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，IL-1β有較強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明干眼發(fā)病過(guò)程中結(jié)膜組織有炎癥浸潤(rùn)。密蒙花滴眼液各濃度治療后，炎性細(xì)胞表達(dá)較模型組明顯減少，充分說(shuō)明密蒙花滴眼液對(duì)干眼眼表炎癥有改善作用，但作用弱于雄激素。同時(shí)，密蒙花中、高濃度組對(duì)于炎癥改善作用強(qiáng)于低濃度組。

淚液滲透壓的升高和淚膜不穩(wěn)定是干眼發(fā)生的兩大核心機(jī)制，如眼表上皮的杯狀細(xì)胞可以分泌成膠型黏蛋白，黏蛋白的作用很多，如影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、免疫、減少摩擦、潤(rùn)滑眼表、減少干燥環(huán)境對(duì)黏膜上皮細(xì)胞的損害，從而對(duì)淚膜穩(wěn)定性的維持具有重要作用。黏蛋白主要有7種，而黏蛋白MUC5AC是構(gòu)成淚膜黏液層的最主要成分，在維持眼表穩(wěn)定方面發(fā)揮著主要作用[14-15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干眼病程中結(jié)膜上皮杯狀細(xì)胞分泌MUC5AC量較空白組減少，經(jīng)過(guò)密蒙花滴眼液局部治療后，增加了結(jié)膜中MUC5AC的表達(dá)，同時(shí)，密蒙花中、高濃度組對(duì)于眼表MUC5AC的分泌作用高于低濃度組。

MAPK參與指導(dǎo)細(xì)胞對(duì)各種刺激的反應(yīng)，如促細(xì)胞分裂素、滲透壓、熱休克和促炎細(xì)胞因子。它們調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，包括增殖，基因表達(dá)、分化、有絲分裂、細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡[16]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)去勢(shì)后結(jié)膜中P38MAPK表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)去勢(shì)雄兔模型組結(jié)膜中可見(jiàn)大量P38MAPK陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明P38MAPK與干眼密切相關(guān)。密蒙花滴眼液各濃度滴雙眼治療后，密蒙花滴眼液通過(guò)下調(diào)P38MAPK蛋白含量，從而下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，其中密蒙花中、高濃度組作用強(qiáng)于低濃度組。我們認(rèn)為密蒙花滴眼劑可能是通過(guò)干預(yù)P38MAPK通路，來(lái)阻斷相關(guān)炎癥反應(yīng)，從而改善眼表癥狀，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

總之，密蒙花滴眼液可以下調(diào)去勢(shì)雄兔干眼結(jié)膜組織中IL-1β、P38MAPK的表達(dá)，增加MUC5AC的表達(dá)，從而減少干眼結(jié)膜組織的炎癥浸潤(rùn)，維持淚膜穩(wěn)定性，本研究表明密蒙花滴眼液對(duì)干眼有一定的療效，為干眼治療提供了新思路，有廣闊的應(yīng)用前景。但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。