硫醇轉(zhuǎn)移酶基因敲除小鼠模型的建立及其白內(nèi)障形成機(jī)制

張 婕，嚴(yán) 宏，Marjorie F.Lou

0 引言

年齡相關(guān)性白內(nèi)障可由多種因素誘發(fā)，包括氧化損傷、紫外線(xiàn)輻射、高血糖、吸煙及遺傳等。氧化損傷是其中最重要的發(fā)病因素。研究證實(shí)，在年齡相關(guān)性白內(nèi)障的晶狀體中，含巰基的抗氧化物和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平急劇下降，含巰基的蛋白質(zhì)廣泛被氧化，形成蛋白質(zhì)與GSH形成的二硫化物(protein-GSH mixed disulfides，PSSG)或蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)形成的二硫化物(protein-protein mixed disulfides，PSSP)；細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜間的大量結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)化為不可溶性蛋白；細(xì)胞膜內(nèi)大部分脂質(zhì)被氧化，以上這些都是導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生的原因[1]。

硫醇轉(zhuǎn)移酶(thioltransferase，TTase)也稱(chēng)為谷氧還蛋白1(glutaredoxin 1，Grx1)，它是巰基-二硫化物的氧化還原酶家族中一個(gè)非常重要的成員。1974年首次在大鼠肝細(xì)胞發(fā)現(xiàn)[2]，隨后在大腸桿菌E.coli中發(fā)現(xiàn)[3]，并且得到廣泛的研究。哺乳動(dòng)物中Grx兩種最主要的同工酶，TTase(Grx1)主要存在于細(xì)胞質(zhì)中[4-5]，Grx2存在于線(xiàn)粒體中[6]，Grx2的功能尚未完全闡明。TTase通過(guò)斷裂晶狀體蛋白質(zhì)氧化形成的二硫鍵(PSSG)使硫醇化的蛋白質(zhì)脫硫醇，保持晶狀體蛋白和膜蛋白的還原狀態(tài)，從而阻止它們交聯(lián)失活，同時(shí)可以通過(guò)調(diào)節(jié)酶活性中心的巰基來(lái)修復(fù)氧化損傷的酶，從而防止白內(nèi)障的產(chǎn)生[4-5]。本研究通過(guò)建立硫醇轉(zhuǎn)移酶基因敲除小鼠模型，觀(guān)察其晶狀體形態(tài)和生化方面隨年齡的改變，探討TTase在晶狀體氧化還原系統(tǒng)中的生理作用及在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要性。

1 材料和方法

1.1材料主要實(shí)驗(yàn)試劑：REDExtract-N-Amp Tissue PCR試劑盒、胎牛血清、GSH含量測(cè)定試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Pierce公司)，抗PSSG單克隆抗體(美國(guó)ViroGeng公司)，抗GAPDH單克隆抗體、抗Beta-actin單克隆抗體、山羊抗鼠IgG2a(美國(guó)Santa Cruz公司)，His-band試劑盒(美國(guó)QIAGEN公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。主要儀器設(shè)備：裂隙燈(美國(guó)Zeiss公司)、離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)，PCR儀、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、化學(xué)發(fā)光成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

圖1小鼠TTase基因敲除過(guò)程。

1.2方法

1.2.1建立TTase基因敲除小鼠模型TTase基因敲除過(guò)程見(jiàn)圖1，該過(guò)程是與南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院合作完成。小鼠TTase基因序列包括3個(gè)外顯子，第1、2外顯子為蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且第2外顯子為GSH結(jié)合部位，第3外顯子為3’-非編碼區(qū)。從129SV小鼠文庫(kù)中克隆出TTase基因組片段，用外源性載體序列(Neo)替換，敲除片段包含了第2個(gè)外顯子和第1、2內(nèi)含子的部分片段。打靶載體用Not I酶切線(xiàn)性化后，轉(zhuǎn)入R1胚胎干細(xì)胞[來(lái)源(129SVx129SVJ)F1]，經(jīng)過(guò)篩選，得到陽(yáng)性克隆。將篩選成功的克隆細(xì)胞植入C57BL/6小鼠的囊胚細(xì)胞，進(jìn)行至少兩代遺傳，由雜合子(TTase+/-)[遺傳背景為(129SVx129SVJ)F1和C57BL/6]小鼠交配后產(chǎn)雜合子、野生型和基因敲除型三種基因型小鼠，采用PCR的方法對(duì)其基因型進(jìn)行鑒定，最后得到TTase基因敲除型小鼠(TTase-/-)[7]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在清潔級(jí)層流動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖，小鼠籠、水、食物、墊料等均經(jīng)消毒處理。采用1只公鼠和1只母鼠交配繁殖后代。母鼠的孕期大約是20d，生育小鼠發(fā)育良好。本研究過(guò)程中動(dòng)物管理符合動(dòng)物保護(hù)條例，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2小鼠基因型鑒定采用REDExtract-N-Amp Tissue PCR試劑盒進(jìn)行小鼠基因組DNA抽提，并采用PCR擴(kuò)增的方法對(duì)所有小鼠基因型進(jìn)行鑒定。

1.2.3裂隙燈觀(guān)察小鼠晶狀體混濁情況分別取不同年齡(1、4、9、12、16月齡)TTase基因敲除型和野生型小鼠，0.5%托吡卡胺和0.5%去氧腎上腺素眼液聯(lián)合散瞳，15min后在裂隙燈下觀(guān)察每只小鼠雙眼晶狀體混濁程度，并根據(jù)晶狀體混濁分級(jí)系統(tǒng)II(LOCSII)[8]進(jìn)行分級(jí)，分析不同基因型小鼠隨年齡增長(zhǎng)白內(nèi)障發(fā)生情況。

1.2.4小鼠晶狀體可溶性蛋白質(zhì)的提取與定量小鼠處死后，立即取出眼球，分離晶狀體并稱(chēng)重，置于干冰上冷凍干燥，-80℃保存待用。加組織裂解液于1～2mL勻漿器中，將晶狀體置于勻漿器中勻漿，并置于冰上，重復(fù)研磨使組織盡量碾碎，裂解30min后，用移液管將裂解液移至1.5mL離心管中，在4℃下13000r/min離心10min，離心2次，取上清置于-80℃保存。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)的總濃度。

1.2.5小鼠晶狀體GSH含量的測(cè)定取晶狀體組織勻漿液于1.5mL離心管中，加等體積20%三醋酸纖維素(TCA)混合，使終濃度為10%，在4℃下13000r/min離心10min，離心2次，取上清備用。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定晶狀體GSH含量。

1.2.6 Western blot檢測(cè)小鼠晶狀體PSSG蛋白質(zhì)的表達(dá)將提取的晶狀體組織勻漿液進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜及脫脂牛奶封閉，之后于4℃冰箱內(nèi)與一抗(1∶1000抗PSSG單克隆抗體)孵育過(guò)夜，室溫漂洗后給予二抗(1∶4000 HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG2a)封閉液中孵育1h，再次漂洗后加入配置好的顯色液，于發(fā)光成像儀Versadoc進(jìn)行化學(xué)發(fā)光及成像并進(jìn)行蛋白條帶的光密度掃描。

圖2小鼠基因型PCR鑒定結(jié)果M：Marker；1～6：小鼠編號(hào)。WT：野生型；TTase KO：TTase基因敲除型。

1.2.7免疫共沉淀法檢測(cè)形成PSSG的蛋白質(zhì)每管中加入20μL晶狀體組織勻漿液，加入RIPA緩沖液至100μL，加入5μg抗體(抗Beta-actin/GAPDH單克隆抗體)，在混勻器上4℃勻速旋轉(zhuǎn)過(guò)夜。每管中加入50μL Beta-actin/GAPDH beads，在混勻器上4℃勻速旋轉(zhuǎn)2h。將免疫沉淀后的溶液于4℃ 2500r/min離心10min，收集上清，加入500μL RIPA緩沖液洗滌beads，4℃ 2500r/min離心10min，棄上清，共洗滌3次。在洗滌完畢的beads中加入2×SDS加樣緩沖液，于100℃煮沸3min后進(jìn)行Western blot檢測(cè)(方法同前)。

1.2.8重組人晶狀體TTase的分離純化及脫硫醇作用檢測(cè)選取轉(zhuǎn)化的攜有重組表達(dá)質(zhì)粒pET23a(+)的大腸桿菌單菌落于5mL LB(Amp+)培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，測(cè)量600nm下吸光光度值，收集4 OD/mL細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至100mL LB(Amp+)培養(yǎng)液中32℃振蕩培養(yǎng)，待吸光光度值達(dá)0.6 OD/mL (2～3h)加入IPTG，42℃誘導(dǎo)6h，4℃下3000r/min離心30min收獲菌體。同時(shí)收取少量表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行全蛋白12% SDS-PAGE分析。離心收集沉淀加入5mL BugBuster和5μL Nucleas懸浮，室溫下緩慢搖勻10min，避免氣泡。4℃下15000r/min離心30min收集上清。上清經(jīng)His-band純化試劑盒進(jìn)行洗脫。將重組液超濾濃縮至2～3mL，-80℃保存。采用12% SDS-PAGE凝膠電泳分析重組蛋白的純化過(guò)程。取晶狀體組織勻漿液，分別與還原型GSH(終濃度為5、10mmol/L)或純化的重組人晶狀體TTase(recombinant human lens TTase，RHLT)0.1U在30℃水浴反應(yīng)30min。反應(yīng)后加入5×SDS加樣緩沖液，于100℃煮沸3min后進(jìn)行Western blot檢測(cè)(方法同前)。

表1 兩種基因型小鼠晶狀體GSH含量

2 結(jié)果

2.1小鼠基因型鑒定及生長(zhǎng)情況不同基因型小鼠基因鑒定的PCR電泳結(jié)果見(jiàn)圖2，TTase基因敲除型小鼠擴(kuò)增出第一對(duì)引物(Neo)，野生型小鼠擴(kuò)增出第二對(duì)引物(TTase)。TTase基因敲除型小鼠和野生型小鼠生長(zhǎng)狀況良好，目前為止最長(zhǎng)觀(guān)察1mo發(fā)現(xiàn)，兩種基因型小鼠在體質(zhì)量、習(xí)性及生長(zhǎng)發(fā)育方面均非常相似。

2.2不同基因型小鼠白內(nèi)障發(fā)生情況在TTase基因敲除型和野生型小鼠中，白內(nèi)障的發(fā)生均隨著年齡增加而增加，混濁類(lèi)型主要為核性，見(jiàn)圖3。在TTase基因敲除型小鼠中，晶狀體混濁最早從4月齡發(fā)生，可見(jiàn)晶狀體核點(diǎn)狀混濁，9月齡晶狀體核混濁明顯加重；而野生型小鼠晶狀體混濁最早從9月齡發(fā)生，12月齡明顯加重。16月齡時(shí)兩種基因型小鼠晶狀體均發(fā)展為成熟期白內(nèi)障。

4月齡TTase基因敲除型小鼠白內(nèi)障發(fā)病率為26%(10/38眼)，野生型小鼠晶狀體均透明(0/22眼)；9月齡TTase基因敲除型小鼠白內(nèi)障發(fā)病率增加至78%(22/28眼)，野生型為40%(8/20眼)；12月齡TTase基因敲除型小鼠晶狀體均發(fā)生混濁(18/18眼)，野生型發(fā)病率為50%(16/32眼)；16月齡兩種基因型小鼠晶狀體均出現(xiàn)明顯混濁(TTase基因敲除型20/20眼；野生型12/12眼)。

2.3不同基因型小鼠晶狀體GSH含量變化觀(guān)察不同年齡(1、4、9、16月齡)TTase基因敲除型和野生型小鼠晶狀體中GSH含量發(fā)現(xiàn)，兩種基因型小鼠晶狀體GSH含量均隨著年齡增加而降低，且9月齡TTase基因敲除型小鼠晶狀體中GSH含量明顯低于野生型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖4。

2.4不同基因型小鼠晶狀體PSSG蛋白質(zhì)的表達(dá)觀(guān)察不同年齡(1、4、9、16月齡)TTase基因敲除型和野生型小鼠晶狀體PSSG蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，兩種基因型小鼠晶狀體中PSSG蛋白質(zhì)的表達(dá)均隨著年齡增加而升高，且形成的PSSG蛋白質(zhì)主要集中在分子量37～50kDa和100kDa以上。比較兩種基因型小鼠晶狀體PSSG蛋白質(zhì)表達(dá)灰度值發(fā)現(xiàn)，4月齡(P<0.05)和9月齡(P<0.01)TTase基因敲除型小鼠晶狀體中高分子PSSG(100kDa以上)蛋白質(zhì)表達(dá)明顯高于同年齡野生型小鼠(圖5)。

2.5免疫共沉淀法鑒定形成PSSG的蛋白質(zhì)Western blot可見(jiàn)PSSG條帶主要集中在分子量37～50kDa，與骨架蛋白Beta-actin(42kDa)和GAPDH(37kDa)分子量相似，因此利用免疫共沉淀法檢測(cè)形成PSSG的蛋白質(zhì)。取組織裂解液分別用抗Beta-actin和抗GAPDH進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，免疫沉淀物經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，并用抗Beta-actin和抗GAPDH抗體進(jìn)行Western blot。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在免疫沉淀產(chǎn)物中可以檢測(cè)到Beta-actin和GAPDH，證實(shí)形成氧化產(chǎn)物PSSG中的蛋白質(zhì)包含Beta-actin和GAPDH(圖6)。

圖3裂隙燈觀(guān)察不同年齡兩種基因型小鼠晶狀體混濁情況1月齡TTase基因敲除型和野生型小鼠晶狀體均透明；4月齡基因敲除型小鼠晶狀體開(kāi)始發(fā)生核點(diǎn)狀混濁，而野生型小鼠晶狀體仍然保持透明；9月齡基因敲除型小鼠可見(jiàn)核性混濁及空泡和小水裂，而野生型小鼠晶狀體僅可見(jiàn)輕度的混濁；12～16月齡兩種基因型小鼠晶狀體混濁均加重，逐漸發(fā)展為成熟期白內(nèi)障，包括皮質(zhì)和后囊下混濁。紅色箭頭示小鼠晶狀體核混濁部位。

圖4不同年齡兩種基因型小鼠晶狀體GSH含量WT：野生型；TTase KO：TTase基因敲除型。aP<0.05vs野生型。

圖5Western blot分析不同基因型小鼠晶狀體PSSG蛋白質(zhì)表達(dá)A：Western blot檢測(cè)結(jié)果；B：不同基因型小鼠晶狀體PSSG 37～50kDa蛋白條帶光密度掃描統(tǒng)計(jì)圖；C：不同基因型小鼠晶狀體PSSG 100kDa以上蛋白條帶光密度掃描統(tǒng)計(jì)圖。WT：野生型；TTase KO：TTase基因敲除型。aP<0.05，bP<0.01vs野生型。

圖6免疫共沉淀法鑒定形成PSSG的蛋白質(zhì)A：免疫共沉淀鑒定Beta-actin；B：免疫共沉淀鑒定GAPDH。Pellet:免疫沉淀物；Supernatant：上清；WT：野生型；TTase KO：TTase基因敲除型。

2.6重組人晶狀體TTase的脫硫醇作用取9月齡TTase基因敲除型小鼠晶狀體裂解液，分別與5、10mmol/L GSH或同時(shí)加入純化的RHLT 0.1U反應(yīng)，形成的PSSG可被還原劑GSH還原，而加入純化的TTase后，更多硫醇化的PSSG可被還原，證明TTase具有脫硫醇作用(圖7)。

3 討論

晶狀體的氧化損傷是年齡相關(guān)性白內(nèi)障形成的重要因素[1,9]。晶狀體中有多重抗氧化屏障，其中包括2種主要蛋白質(zhì)/酶修復(fù)系統(tǒng)：(1)GSH依賴(lài)的TTase/Grx系統(tǒng)，通過(guò)切斷晶狀體蛋白質(zhì)和GSH硫醇化形成的二硫化物(PSSG)維持晶狀體的還原狀態(tài)[10]；(2)NADPH依賴(lài)的硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)系統(tǒng)，可以有效還原蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間形成的二硫鍵(PSSP)[11-12]。這些抗氧化系統(tǒng)可以獨(dú)立或聯(lián)合發(fā)揮作用，保持晶狀體的氧化還原平衡，從而防止白內(nèi)障的形成。本研究通過(guò)建立TTase基因敲除小鼠模型，觀(guān)察其白內(nèi)障的發(fā)生情況，進(jìn)一步探討TTase在白內(nèi)障發(fā)病中的保護(hù)機(jī)制。

圖7Western blot分析TTase的脫硫醇作用control：TTase基因敲除小鼠晶狀體裂解液，未加入 GSH或純化的TTase。

小鼠TTase基因序列包括3個(gè)外顯子，其中GSH結(jié)合氨基酸位點(diǎn)編碼于第2外顯子，本研究通過(guò)敲除第2外顯子建立TTase基因敲除小鼠模型。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，TTase基因敲除型小鼠晶狀體上皮細(xì)胞及其他組織如腦、心、腎均無(wú)TTase表達(dá)[7]。目前觀(guān)察TTase基因敲除型小鼠在體質(zhì)量、習(xí)性及生長(zhǎng)發(fā)育方面與野生型小鼠都非常相似。兩種基因型小鼠白內(nèi)障的發(fā)生均呈年齡相關(guān)性，且混濁部位表現(xiàn)為核性混濁。TTase基因敲除型小鼠中白內(nèi)障最早從4月齡開(kāi)始發(fā)生，9月齡明顯加重；而野生型小鼠最早從9月齡開(kāi)始發(fā)生，12月齡時(shí)明顯加重。至16月齡時(shí)，兩種基因型小鼠晶狀體均發(fā)生明顯混濁。結(jié)果提示TTase基因敲除可以加快年齡相關(guān)性白內(nèi)障的發(fā)生。

GSH 是晶狀體中重要的還原物，其可以通過(guò)一系列代謝反應(yīng)和抗壞血酸不斷產(chǎn)生[13]。GSH的損失是發(fā)生老化和白內(nèi)障形成的重要標(biāo)志之一[1]。比較兩種基因型小鼠晶狀體GSH含量發(fā)現(xiàn)，GSH均隨年齡增加而降低，且9月齡TTase基因敲除型小鼠晶狀體中GSH含量明顯低于野生型，分析與兩種基因型小鼠白內(nèi)障的發(fā)生相關(guān)，9月齡TTase基因敲除型小鼠白內(nèi)障的發(fā)生率明顯高于同年齡野生型小鼠。結(jié)果提示TTase基因敲除可以加速GSH的損失。

本課題組前期進(jìn)行細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，TTase等抗氧化酶在紫外線(xiàn)(UV)照射后表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明TTase在抵抗晶狀體蛋白質(zhì)免受紫外線(xiàn)等氧化損傷方面發(fā)揮重要作用[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，在年齡相關(guān)性白內(nèi)障(包括核性、皮質(zhì)性、混合性)患者的晶狀體中，TTase的活性明顯下降[17]。TTase的重要功能之一是通過(guò)脫硫醇作用來(lái)還原氧化損傷后的蛋白質(zhì)或酶形成的PSSG，從而修復(fù)其功能或活性。PSSG的形成可以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且晶狀體中PSSG的積聚可以引起蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間二硫鍵的形成和交聯(lián)，最終導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生[18]。在本研究中兩組基因型小鼠晶狀體PSSG均隨年齡增加而增加，且9月齡TTase基因敲除型小鼠晶狀體中PSSG表達(dá)明顯高于同年齡野生型小鼠，主要為高分子聚合物，分析與白內(nèi)障的發(fā)生情況相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，硫醇化形成PSSG的蛋白質(zhì)之一為肌動(dòng)蛋白(actin)，其是一條由多肽鏈構(gòu)成的分子量為42kDa的球型分子，與肌球蛋白結(jié)合構(gòu)成微絲后有多種生物學(xué)功能，如構(gòu)成細(xì)胞骨架、維持細(xì)胞形狀；參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分泌等活動(dòng)；參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞；參與蛋白質(zhì)的合成等。大量研究表明，肌動(dòng)蛋白因含有大量巰基而易被氧化損傷[19]。另一種被硫醇化的蛋白質(zhì)為GAPDH(37kDa)，它在糖酵解途徑中對(duì)氧化損傷最敏感。GAPDH有4個(gè)亞基，每個(gè)亞基都包括4個(gè)巰基(-SH)，其中2個(gè)巰基位于活性中心(Cys-149)，而活性中心的氧化會(huì)導(dǎo)致其酶活性的喪失[20]。由于晶狀體屬于無(wú)氧代謝，這種代謝在晶狀體中尤為重要。Xing等[21]發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞與低濃度H2O2孵育后，GAPDH可以和GSH被硫醇化生成PSSG。抵抗氧化損傷引起的細(xì)胞毒性及發(fā)生永久性修飾，這種硫醇化反應(yīng)也對(duì)GAPDH及其他酶起到保護(hù)作用[22]。本研究表明，形成硫醇化的肌動(dòng)蛋白及GAPDH可被還原劑GSH還原。而加入純化的TTase后，更多硫醇化的PSSG被還原。證實(shí)了這些條帶是形成二硫化物的蛋白質(zhì)，證明TTase通過(guò)斷裂氧化形成的二硫鍵，使晶狀體中硫醇化的蛋白質(zhì)脫硫醇，阻止它們交聯(lián)失活，從而使晶狀體蛋白以及膜蛋白保持還原狀態(tài)，防止白內(nèi)障的產(chǎn)生。

綜上所述，本研究通過(guò)建立TTase基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)TTase基因敲除可以加速小鼠白內(nèi)障的發(fā)生。晶狀體中PSSG的聚積隨年齡的增加而增加，且與晶狀體的混濁程度相關(guān)。這種形成二硫化物的蛋白質(zhì)主要是肌動(dòng)蛋白和GAPDH，且可被GSH聯(lián)合RHLT還原，證實(shí)了TTase的脫硫醇作用。