GC-MS用于花果香氣成分研究進展

張會，郭磊，王軍民，譚大聰，華燕

（西南林業(yè)大學云南森林資源培育與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南昆明650224）

花果香氣成分與花果的質量、加工及營養(yǎng)價值密切相關。香氣成分是其能否博得消費者的喜歡、是否是市場主力的主要考察因素。植物香氣成分，是一類分子量較小的次生代謝物，在植物學界也稱之為精油。目前已知含精油較多的植物有龍腦香科、蕓香科、禾本科、樟科、姜科、桃金娘科、木蘭科、柏科等。植物的營養(yǎng)器官和生殖器官均有香氣成分分布，不同部位含量有所不同[1]。有些植物的根、莖、葉、皮、花或果等可作為天然香料，但花果的香氣最為突出，也是最具經(jīng)濟價值的部位，香氣成分是其主要特征。研究香氣成分，有利于優(yōu)化品種特性，提高經(jīng)濟效益。

近年來，國內外有許多關于香氣成分的研究方法、各種花果的香氣成分及其不同品種之間的成分差異的研究[2-4]。香氣成分的前處理方法有同時蒸餾萃取法 （simultaneous distillation and solvent extraction，SDE）、超臨界流體萃取法（supercritical fluid extraction，SFE）、頂空法（headspace，HS）、固相微萃取法（solidphase microextraction，SPME），通常使用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用技術對其進行檢測。本文對香氣成分的主要研究方法進行對比分析，闡述其用于香氣成分的研究特點。同時，總結常見花果及其加工制品的香氣成分差異，介紹花香的生物功能，為香氣成分的基因分析及其相關研究提供依據(jù)。

1 花果香氣成分的研究方法

花果香氣成分的研究流程主要包括以下5 個方面，樣品采集與制備、樣品前處理、采集數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)處理與分析以及生物學解釋。根據(jù)研究目的和對象不同采取合適的存放條件，分析含水量較高的揮發(fā)性組分時，取樣后，先用液氮研磨粉末，低溫保存，如黃瓜、番茄、草莓等。揮發(fā)性植物代謝譜的采集常采用固相微萃取的前處理方法，非揮發(fā)性植物代謝物譜需進行衍生化處理。運用氣質聯(lián)用檢測其中代謝物的種類、含量，得到代謝圖譜，對原始數(shù)據(jù)進行處理分析，找出差異代謝物，進行生物學解釋?；ü銡獬煞值难芯苛鞒炭蓺w納如圖1 所示。

圖1 花果香氣成分的研究流程Fig.1 The analysis flow of aroma components

1.1 前處理方法

同時蒸餾萃取法、超臨界流體萃取法、頂空法、固相微萃取法等幾種方法均可用于提取香氣成分。SDE[2]是Nickerson 和Likens 在1964 年設計的一種將水蒸氣蒸餾和溶劑萃取結合起來的分析方法。SDE 的優(yōu)點是操作簡便，香氣的回收率和提取率均較高。但由于整個分析過程是在高溫密閉的環(huán)境下進行，熱敏感的香氣組分會受到影響，從而導致分析不完全，不能反映原料的完整香氣特征。SFE 是指當溫度和壓力均超過臨界點時，作為溶劑的超臨界流體將從樣品中萃取目標物。該方法的優(yōu)點是有效保護揮發(fā)性物質中的熱敏性成分不被破壞，缺點則是工藝要求高，費用大。SPME 和HS 是香氣成分研究中最常使用的方法。Arthur C L 等[5]在 1990 年首次應用 SPME，萃取、濃縮同時進行且無需溶劑，使樣品的制備變得更加簡單。SPME 萃取效率主要取決于幾個可優(yōu)化的因素，如要提取的化合物性質、提取溫度、提取時間、纖維的涂層材料以及鹽析效果等[6]。SPME 提取技術快速、簡便，適用于從水溶液中提取和濃縮揮發(fā)性和半揮發(fā)性化合物。相對SPME 來說，HS 不使用昂貴的萃取頭，直接進樣頂部空間的揮發(fā)性氣體，不足之處則在于沒有富集的過程，同樣的檢測條件，HS 檢測到的化合物相對少于SPME。HS 和SPME 的主要區(qū)別在于：HS 沒有富集樣品的過程，而SPME 使用了萃取頭富集，檢測到的化合物更多。Zhong 等[7]使用SPME 的前處理方法，GCMS 聯(lián)用技術檢測到紫蘇中所含揮發(fā)性成分單萜、倍半萜、脂肪酸等56 個。

1.2 檢測方法

GC-MS 聯(lián)用技術主要分析易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化或衍生化后具有揮發(fā)性的小分子代謝物[8]。它因其具有較高的靈敏度、分辨率和大量標準譜庫而成為目前揮發(fā)性成分的主要分析平臺之一，常被用于分析農產品中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性代謝物[9]。此外，氣相色譜與飛行時間質譜（gas chromatography-time of flight，GC-TOF）結合，使用非靶向分析可獲得大量的化學信息，這主要是因為其具有分析物檢測速度快和反卷積處理效率高等優(yōu)點[10]。評價花果品質還有一種感官分析方法，但是感官分析受人的主觀意識影響較大，對產品的最終評價將造成不可避免的誤差?；诓溉閯游镄嵊X和味覺機理的人工電子鼻和電子舌正好能夠彌補此不足之處。電子鼻系統(tǒng)由氣敏傳感器、信號處理模塊和模式識別三大部分組成，具有識別氣體的能力[11]。與電子鼻結構類似，電子舌的組成也同樣分為這三部分。與電子鼻不同的是，電子舌檢測的對象是液體，其工作原理與電子鼻類似。電子舌的工作原理是：味覺傳感器感受到樣品中的不同呈味物質，從而產生電信號；信號調節(jié)電路，電信號放大電路；進行模數(shù)轉換，將這些信號發(fā)送至電腦；軟件分析，進行模式識別分析；最后做出判斷并輸出結果[12]。GC-MS 與電子舌結合對花果品質的檢測研究較少。Escriche 等[13]采用伏安型電子舌檢測不同處理的蜂蜜，經(jīng)過主成分分析和人工神經(jīng)網(wǎng)絡分析后，對來自不同產地的蜂蜜具有很好的區(qū)分度。

2 花果香氣成分的物質種類

2.1 花香

花香是觀賞植物所具有的重要性狀特征，人們不僅僅只在意花的觀賞價值給人帶來的視覺美感，同時也期望其芳香性狀越來越好。隨著分析儀器和樣品前處理技術的迅速發(fā)展，花香研究也進行地比較順利。桂花、丁香花、白蘭花、茉莉花、梔子花等常見園林樹木花的揮發(fā)性物質已初步鑒定?，F(xiàn)將常見植物花香的主要香氣成分歸納如表1。

目前，從桂花（Osmanthus frsgrans Lou.）中鑒定到60 多種香氣物質[15]。使用GC-MS 聯(lián)用技術檢測白蘭花（Michelia alba DC.）所含的香氣成分，芳樟醇是其主要香氣成分[16]。李麗華等[17]采用HS-SPME/GC-MS 聯(lián)用技術分析茉莉花（Jasminum sambac L.）的香氣成分，分別采用3 種萃取頭型號DVB、PDMS、PA，分離出100 多種香氣成分，所得主成分基本一致。分別使用動態(tài)頂空法和固相微萃取法分離梔子花（Gardenia）的香氣成分，用GC-MS 技術分析檢測到54 種香氣物質[18]。陳奇奇[19]利用頂空進樣對棗花（Ziziphus jujuba Mill.）的香氣成分進行分析。經(jīng)系統(tǒng)譜庫檢索、譜圖分析，9 個品種的棗花共鑒定出60 個化合物，蜜蜂罐棗花的4 個器官共鑒定出59 個化合物，不同樣品揮發(fā)性物質有所差異，但主要成分都是酯類、醛類、酮類、烷烴類。

表1 植物花香的主要香氣成分Table 1 The main aroma of plant fragrance

快速的科技發(fā)展將花香成分的研究推向了新高度，使得代謝組學與基因組學整合起來。白玉蘭（Magnolia Champaca），是一種因花香而出名的樹。這些花香廣泛應用于香精和香料行業(yè)。盡管具有重要的商業(yè)意義，但這些花卉中的VOCs 生物合成途徑鮮為人知。Savitha 團隊[20]結合代謝物和 RNA 序列（RNA-seq）對完全開放的白玉蘭進行分析，用頂空法和氣相色譜-質譜法聯(lián)合分析。共鑒定出43 種揮發(fā)性有機物，其中46.9%為萜類化合物，38.9%為揮發(fā)性酯類，5.2%為苯丙類/苯類化合物。VOCs 詳細輪廓譜使得從RNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了與花香味生物合成有關的通路和基因。對花和葉中許多與花香合成相關的單基因表達水平的分析表明，大多數(shù)基因在花中的表達量高于在葉片組織中的表達量。

雖然國內學者對花香的研究取得了一些進展，但大多仍徘徊于不同品種之間的香氣成分區(qū)別研究，不同種類植物花香組分的分析，其代謝與合成途徑研究很少。近20 年來，國內外研究人員開始研究花香物質的代謝路徑及其基因和相關酶的作用機理，了解香氣的形成機制，為培育新品種提供理論依據(jù)[22]。由于復雜的植物代謝和種屬特異性，花香物質代謝機理還有許多問題。例如，一些目標基因的過表達或抑制，并沒有對目標代謝產物產生影響。在不同的植物體或轉化體中，仍然存在目標基因表達差異大，酶活性高低與目標產物合成及限速酶基因表達有時不一致等問題。因此，植物花香成分代謝途徑的基因工程仍然面臨著很多具有挑戰(zhàn)性的任務，應用基因工程技術對植物花香物質代謝途徑進行改良時，應與常規(guī)育種技術相結合，穩(wěn)定花香性狀的同時，有效整合優(yōu)良性狀，培育新品種。隨著對植物花香物質代謝途徑的全面解析、克隆相關基因以及現(xiàn)代生物技術的不斷進步，現(xiàn)有植物性狀將更加有效地改造，培育出色香型俱佳的觀賞植物，構建芳香幽幽的園林，帶來可觀的經(jīng)濟效益和社會效益。

2.2 果香

隨著食品工業(yè)對天然風味成分需求的增加以及國際市場對果品品質的要求越來越高，果品香氣受到大眾的日益關注。果實的揮發(fā)性香氣化合物多達2 000余種，主要香氣成分類別見表2。

表2 常見果實的主要香氣成分Table 2 Main aroma components of common fruits

香氣成分種類及其含量客觀地反映出不同果品所具有的風味特點，是評價其風味的重要指標之一。香氣成分會在一定程度上指示食品的營養(yǎng)價值和健康狀況[30]，草莓因其具有令人愉悅的香味和營養(yǎng)而世界聞名。研究表明，甜味和復雜風味是“理想”草莓體驗的一貫優(yōu)點[31]。調查研究表明，在草莓中鑒定出300多種香氣成分[29]。不同果實的香氣由不同的揮發(fā)性成分組成，這體現(xiàn)出品種之間的差異性。研究香氣成分對提高果實質量、育種及其深加工等均具有重要意義。20 世紀60 年代開始研究果實香氣成分，起初多研究葡萄、草莓等常見水果[32]。80 年代重點研究香氣物質對水果的感官貢獻。然而，由于儀器設備落后，測定結果不準確，限制了其發(fā)展。進入90 年代后，隨著GC-MS 技術的發(fā)展，以及開發(fā)了新型香氣成分提取方法SPME[5]。國內外在不同果實香氣成分的測定方面取得了一些階段性的成果，香氣成分的研究也進行地更加廣泛更加深入。在果實的不同發(fā)育階段，香氣成分及含量差異較大。張序等[24]研究“紅燈”甜櫻桃發(fā)育過程中香氣成分的組分及積累過程，櫻桃成熟時，其成熟特征性香氣成分見表2。研究“新世紀”、“紅豐”兩個杏品種所含香氣成分，分別鑒定出74 種和72 種[25]。劉勝輝等[27]采用HS-SPME/GC-MS 分析3 個不同品種的楊桃成熟果實。不同沙果品種，香氣成分種類及含量不盡相同，“大花紅”與“泰山花紅”果實香氣物質以醇類為主，分別占總含量的79.27%和67.24%；“秋風蜜”、“一窩蜂”、“小花紅”和“萊蕪花紅”的果實香氣成分以酯類為主，其含量分別占總含量的98.86%、94.62%、81.35%和 73.56%[33]。研究臺農 21、Phuket、Josapine 等6 個菠蘿品種揮發(fā)物種類。結果表明：MD-2、MacGregor、臺農 21、Phuket 以酯類為主，而 Josapine 以萜烯類為主。引自馬來西亞的Josapine 與其他5 個品種的揮發(fā)性物質差異較大[28]。綜上所述，同一果品，不同品種，主要香氣物質有相同也有不同，不能一概而論。

結合感官評價和儀器分析，對食品的風味和口感進行研究。采用多元統(tǒng)計分析方法，水果中存在的許多VOCs 對香氣和風味有積極的促進作用，能給人留下愉快的印象[34]。在過去的30 年里，草莓育種計劃的主要目標是提高農藝表現(xiàn)，從而生產出鮮艷的大型果實。但研究發(fā)現(xiàn)其香味才是影響消費者的主要品質性狀[31，35]。但只有少數(shù)被報道對人類感知到的草莓香氣有貢獻[36-38]。與其他水果作物一樣，生物合成途徑、酶和揮發(fā)性化合物積累的調控在草莓屬中也得到了部分闡明。Goff[30]研究發(fā)現(xiàn)果實的揮發(fā)性特征取決于遺傳（水果種類和品種）、發(fā)育階段和采后因素以及分析技術。Samykanno[39]使用GC×GC-MS 檢測兩個澳大利亞生長的草莓品種，從中鑒定了94 個化合物。

利用 GC-MS 技術，結合 HS、SPME 或者 HSSPME 等前處理方法進行揮發(fā)性成分的研究現(xiàn)已廣泛開展。Colinacoca 等[3]建立一種新方法，使用HS-GCMS 檢測方法分析洋蔥中的揮發(fā)性物質，鑒定到18 種揮發(fā)性成分并定量分析其中9 種。至今，最為成功的分析技術是 HS-SPME/GC-MS[40-41]。2014 年，Allwood 等[42]提出了一種簡單可靠的聚二甲基硅氧烷（poly dimethyl siloxane，PDMS）分析方法。通過主成分分析，在香瓜中檢測到58 種VOCs。通過與傳統(tǒng)的SPME-GC-MS 分析數(shù)據(jù)比較，表明高通量PDMS 分析方法對香瓜香氣和品質的評價具有很大的潛力。Vrhovsek 等[43]開發(fā)并驗證一種通用的GC-MS/MS 方法，利用該技術分析蘋果、覆盆子和葡萄中的揮發(fā)性化合物。主要類別是酯類、醇、單萜類、醛、酮、酸、去甲異丙烯酮、倍半萜、吡嗪和醚，蘋果中的69 種化合物、葡萄中的122 種和覆盆子中的42 種。該方法易于推廣到其他水果中的揮發(fā)性化合物，因此可廣泛應用于水果香氣領域的定性或定量研究。

2.3 加工制品的香氣成分

由植物花和果制成的加工品尤其之多，最常見的莫過于葡萄酒。葡萄酒的香氣成分研究較早。早在上世紀五十年代，Bayer 等[44]首次采用氣相色譜技術對葡萄酒的揮發(fā)性組分進行了研究，并成功鑒定出了一些酯類和高級醇物質。色譜質譜等現(xiàn)代分析方法的發(fā)展，為揮發(fā)性物質的研究提供了重要的分析手段。目前，從葡萄酒中鑒定出的揮發(fā)性成分大約有800 多種，主要包括萜烯類、酯類、內酯類、醇類、有機酸類、揮發(fā)性酚類和雜環(huán)類化合物等[45]。近年來，對于葡萄酒的香氣成分研究主要集中于不同制作方法和不同采摘期，區(qū)分葡萄酒香氣成分。李娜娜等[46]研究表明，3 個采收期，蒸餾酒品種最好的是采于8 月18 日的葡萄制成；葡萄酒質量最好的是9 月5 日采收的。因此，制作不同的加工品，需研究其最佳采收原料時間，使得香氣質量最好。除了葡萄酒還有人用草莓釀造草莓酒，HSSPME/GC-MS 分析草莓酒的香氣成分，共鑒定出32 種成分，主成分為乙醇、異戊醇、正丙醇、十六酸2-甲基丙酯等，主要為醇類和酯類[47]。蘋果酒香氣是評價蘋果酒質量的重要指標，其香氣成分是影響蘋果酒品質的主要影響因素。蘋果酒的香氣成分主要是一些高級醇類、酯類、內酯、縮醛、萜烯和低級脂肪酸等微量成分[48]。

3 花香的功能

植物花朵的芳香來源于花瓣或花被釋放的多種揮發(fā)性香氣成分?；ㄏ銚]發(fā)物的釋放不僅是植物引誘昆蟲授粉、受精的重要表達信號，也是植物對食草生物主動防御的適應機制。而且，植物的花香能使人心情愉悅，是表征觀賞植物的重要指標。大自然中的許多植物花朵都能散發(fā)出香氣，許多香氣成分混合在一起形成了花香，不同的香氣成分及其含量差異構成了其獨特的顯著特征。普遍認為花香有兩種功能：吸引昆蟲授粉以及抵御昆蟲侵害[49]。許多種類的植物不能進行自花授粉，需要吸引昆蟲進行授粉從而繁殖?；ǘ淦恋耐庑魏推G麗的色彩與花香一起作用吸引昆蟲[50]。根據(jù)花香特性，昆蟲訪問具有它感興趣花香的植物花朵。另外一些花朵通過其揮發(fā)出來的氣味抵御或避免昆蟲對自己的傷害，或者當植物被細菌真菌感染后，花香作為信號激起免疫反應進行自愈。

植物花朵所具有的揮發(fā)性物質是其次生代謝產物，在植物的傳粉過程中擔任著至關重要的角色。開花過程中，香氣成分的種類、含量及其比例對引誘傳粉者覓食影響較大[51]，并為花香代謝與調控提供理論依據(jù)[52]。趙印泉等[53]以“三輪玉蝶”梅花為材料，使用HS-SPME/GC-MS 聯(lián)用技術，研究梅花香氣物質的時空動態(tài)變化，對5 個不同階段的花朵及不同花器官釋放的香氣成分進行檢測。推測，在開花的第4 階段，花萼、雌蕊群和花盤釋放乙酸己酯含量較高，丁子香酚含量較低，這或許是引誘蜜蜂覓食的重要信號。

4 小結與展望

有綜述表明[29]，不同的前處理方法，提取草莓中的香氣成分，重現(xiàn)性較差。在其整理的25 項研究中，沒有一種物質在所有的研究中均被檢測到。而且，有67%的物質只在一項研究中所檢測到。前期總結花果香氣成分的前處理方法，例如同時蒸餾萃取法、超臨界流體萃取法、頂空法、固相微萃取法，每個方法各有優(yōu)缺點。綜合比較，SPME 萃取效果最佳，能檢測到較多香氣成分，但由于其萃取頭的纖維材料制作不盡完全相同，且隨著時間的推移，使用程度對其纖維有所損傷，因而，同一處理之間的數(shù)據(jù)重復性較差，且不能對香氣成分進行完全定量。所以，在今后的研究中，為減少試驗誤差，找到一種重現(xiàn)性穩(wěn)定性較好的研究方法至關重要。分析花果香氣成分的研究很多，但迄今為止，仍然不存在一種方法能夠適用于多種材料。目前，對高復雜混合物的大規(guī)模分析采用了一系列的綜合技術和方法。近年來，有報道稱，利用基因工程的方法可以改良植物花果香氣，比如倍半萜合成酶基因[54]、法呢基焦磷酸合成酶基因[55]等花香基因。目前，對花果香氣成分的研究已取得一些進展。但大多只研究不同花果種類、不同品種之間的香氣物質及含量差異，而對香氣的形成過程及相關酶的作用機制研究很少。應加大對改善花果的香氣及提高花果質量的研究。此外，香氣是通過人體嗅覺器官感知而評價的。因此，香氣物質的鑒定須結合感官評價，才會使香氣成分的研究更有意義。在未來，應該越來越重視氣相色譜與感官分析相結合。