高效液相色譜法測(cè)定黃酒發(fā)酵醪液中生物胺含量

牛天嬌，郭永杰，孫二娜，馬鶯

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001；2.蒙牛高科乳制品（北京）有限責(zé)任公司，北京101107）

生物胺是一種由有機(jī)生物體產(chǎn)生的含氮的小分子堿性有機(jī)化合物的總稱(chēng)，適量的生物胺是人體的正?；钚猿煞諿1]，而過(guò)量的生物胺則會(huì)引起血管、動(dòng)脈的擴(kuò)張，導(dǎo)致生物體出現(xiàn)頭疼、心慌、腹瀉、腹部抽搐和呼吸紊亂等一系列不良癥狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)危及生命[2]。發(fā)酵食品中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有大量的蛋白質(zhì)，在蛋白酶和微生物的共同作用下會(huì)產(chǎn)生大量的生物胺，水產(chǎn)發(fā)酵制品[3]、肉制品[4]、乳制品[5]、酒中[6]均有生物胺，尤其是黃酒[7]中。

中國(guó)黃酒釀造歷史悠久，因其獨(dú)特的風(fēng)味和高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而深受?chē)?guó)人的喜愛(ài)。黃酒主要以谷物、稻米等為原料，經(jīng)過(guò)酵母、霉菌和細(xì)菌的共同發(fā)酵而成[8-10]。豐富的微生物體系產(chǎn)生大量的蛋白酶和氨基酸脫羧酶[11-12]，蛋白酶將黃酒發(fā)酵過(guò)程中的蛋白質(zhì)分解為氨基酸，在氨基酸脫羧酶的進(jìn)一步作用下經(jīng)過(guò)脫羧反應(yīng)形成大量生物胺[13]。而且，黃酒中的酒精會(huì)抑制生物胺降解酶-胺氧化酶的活性[14]，因此黃酒中存在較高的生物胺風(fēng)險(xiǎn)。為尋找控制黃酒中生物胺的方法，追蹤檢測(cè)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵醪液的生物胺含量變化尤為必要。

根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，黃酒中生物胺含量的測(cè)定方法有很多，如高效液相色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、生物傳感器法等[15-17]。目前，應(yīng)用最為廣泛的是國(guó)標(biāo)GB/T 5009.208-2016《食品中生物胺含量的測(cè)定》中的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）法[18]。但是國(guó)標(biāo)中針對(duì)酒類(lèi)中生物胺的檢測(cè)方法是針對(duì)成品酒（液體）制定的，缺少針對(duì)黃酒發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵醪液（固液混合物）的生物胺含量測(cè)定方法。少數(shù)文獻(xiàn)中報(bào)道了黃酒醪液中生物胺的檢測(cè)，欒同青[19]采用了改進(jìn)的高效液相色譜法測(cè)定黃酒發(fā)酵過(guò)程中生物胺含量，但其方法只對(duì)組胺、酪胺和腐胺3 種生物胺的分離效果較好。許祿等[20]建立了一種HPLC-MS/MS 的方法測(cè)定黃酒發(fā)酵過(guò)程中生物胺含量，但由于質(zhì)譜儀檢測(cè)成本較高，應(yīng)用受到限制。因此，本研究在酒類(lèi)中生物胺檢測(cè)的國(guó)標(biāo)方法基礎(chǔ)上，增加了三氯乙酸提取步驟，并簡(jiǎn)化了流動(dòng)相，建立了一種簡(jiǎn)便可靠的針對(duì)黃酒發(fā)酵醪液中8 種常見(jiàn)生物胺的檢測(cè)方法并進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

在浙江紹興某黃酒廠(chǎng)采集不同批次黃酒發(fā)酵醪液樣品，每組樣品3 個(gè)平行。

1.1.2 化學(xué)試劑

色胺、苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、組胺、精胺、亞精胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）、乙腈（色譜純）、丹磺酰氯（純度＞99%）：美國(guó) Sigma 公司；正丁醇、三氯甲烷、鹽酸、三氯乙酸、丙酮、飽和碳酸氫鈉、氫氧化鈉、谷氨酸鈉、氯化鈉、無(wú)水乙醚（均為分析純）：天津市大陸化學(xué)試劑廠(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT 高效液相色譜儀：日本島津有限公司；安捷倫C18 柱：上海科曉科學(xué)儀器有限公司；DC-12型氮吹儀：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；DK-8B型恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；MS2 型渦旋振蕩器：德國(guó)IKA 公司；Sigma 3K30 型低溫高速離心機(jī)：德國(guó) Satorious；UF/UVPL5124 超純水儀：美國(guó) Pall 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 取樣

浙江紹興某黃酒廠(chǎng)采集7 個(gè)不同批次的黃酒發(fā)酵醪液樣品，采集樣品存放在滅菌瓶子中冷凍運(yùn)輸和保存。

1.3.2 高效液相色譜法測(cè)定生物胺含量

1.3.2.1 樣品的前處理

取黃酒發(fā)酵醪液10.00 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入20 mL 5%三氯乙酸溶液并振蕩提取30 min，轉(zhuǎn)移至50 mL 具塞離心管中，5 000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL 容量瓶中。移取上清液15 mL，加入適量的NaCl 使溶液飽和。稱(chēng)取飽和后的樣品溶液5 mL，置于10 mL 具塞離心管中，加入0.65 mL2.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至12.0 左右。加入5 mL 等比例混合的正丁醇和三氯甲烷溶液，渦旋振蕩5 min，5 000 r/min 離心5min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相于另一個(gè)10 mL具塞離心管中，下層樣液再萃取一次，合并萃取液，用等比例混合的正丁醇和三氯甲烷溶液稀釋至刻度。取5 mL 萃取液加入 200 μL 鹽酸（1 mol/L），混合后 40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?，加? mL 鹽酸（0.1 mol/L）渦旋振蕩，使殘留物完全溶解，待衍生[18]。

1.3.2.2 樣品的衍生

在待衍生試樣中依次加入1 mL 飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL 氫氧化鈉溶液（1 mol/L）、1 mL 丹磺酰氯衍生試劑，渦旋混勻1 min 后置于60 ℃恒溫水浴中衍生15 min，取出，加入100 μL 谷氨酸鈉溶液，振蕩混勻，60 ℃恒溫反應(yīng)15 min。取出冷卻至室溫25 ℃，于每個(gè)離心管中加入1 mL 水，渦旋混合1 min，40 ℃水浴下氮吹除去丙酮（約1 mL），加入0.5 g 氯化鈉渦旋振蕩至氯化鈉完全溶解后加入5 mL 乙醚，渦旋振蕩2 min，靜置分層后，吸出上層有機(jī)相（乙醚層），再萃取一次，合并乙醚萃取液，40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?。加? mL 乙腈渦旋振蕩使殘留物完全溶解，0.22 μm 濾膜針頭濾器過(guò)濾于進(jìn)樣小瓶，待測(cè)定[18]。

1.3.2.3 色譜條件

色譜柱：安捷倫 C18柱（5 μm，150 mm×4.6 mm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣 20 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B 為超純水，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。標(biāo)準(zhǔn)品譜圖和樣品譜圖見(jiàn)圖2 和圖3。

1.3.2.4 生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別吸取1.0 mL 各生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于10 mL離心管中，用0.1 mol/L HCl 溶液稀釋至5 mL，混勻，得到濃度為200 mg/L 的生物胺標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0.05、0.30、0.5、1.25、2.5、5、7.5 mL 上述制得的濃度為200 mg/L 的各生物胺標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL 離心管中，用0.1 mol/L HCl 溶液稀釋至10 mL，混勻，使?jié)舛确謩e為1、6、10、25、50、100、150 mg/L。取各系列生物胺標(biāo)準(zhǔn)液1.0 mL，柱前衍生后，利用高效液相測(cè)定其生物胺含量，以生物胺含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制8 種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

表1 HPLC 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of HPLC

圖1 生物胺HPLC 標(biāo)準(zhǔn)品譜圖Fig.1 HPLC chromatographic profile of a biogenic amines standard solution

圖2 生物胺HPLC 樣品譜圖Fig.2 HPLC chromatographic profile of a biogenic amines sample solution

1.3.2.5 精密度試驗(yàn)

取10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品，根據(jù)1.3.2.2 方法對(duì)其進(jìn)行衍生，然后在1 d 內(nèi)和連續(xù)3 d 分別進(jìn)行相同衍生標(biāo)品的6 次的進(jìn)樣試驗(yàn)，測(cè)定8 種生物胺含量，根據(jù)結(jié)果計(jì)算保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和質(zhì)量濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在黃酒樣品中加入濃度為10 mg/L 的混合生物胺標(biāo)準(zhǔn)品工作液，平行測(cè)定6 次，計(jì)算8 種生物胺的加標(biāo)回收率。

1.3.2.7 數(shù)據(jù)處理

黃酒樣品均以3 個(gè)獨(dú)立的方式制備，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。采用SPSS19.0 軟件計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，同時(shí)進(jìn)行方差分析，方差分析如無(wú)特殊說(shuō)明均為P<0.05 時(shí)具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、檢出限和定量限

將濃度為 1、6、10、25、50、100、150 mg/L 的生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液按照次序進(jìn)樣，根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積（y）對(duì)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，檢出限的判斷標(biāo)準(zhǔn)為信噪比（S/N）＞3，定量限的判斷標(biāo)準(zhǔn)為信噪比＞10，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2 可知，8 種生物胺的線(xiàn)性范圍在0.5 mg/L～20 mg/L，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2均≥0.999，說(shuō)明符合測(cè)定的要求。苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的檢出限的范圍為0.187 mg/L～0.317 mg/L，定量限的范圍是0.323 mg/L～0.887 mg/L，而色胺的檢出限為0.35 mg/L，定量限為1.06 mg/L。從結(jié)果可以看出該方法對(duì)8 種生物胺（色胺除外）靈敏度高，能滿(mǎn)足樣品測(cè)定的要求。

表2 生物胺回歸曲線(xiàn)、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限Table 2 Regression equations of the standard curve，correlation index，linearity range，detection limit and quantification limit of biogenic amines derivatives

2.2 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)的保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）和質(zhì)量濃度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表3 所示。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision tests

由表3 可知，保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值均＜1%，色胺、苯乙胺、腐胺、組胺、亞精胺和精胺的質(zhì)量濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值均＜5 %，說(shuō)明精密度符合檢測(cè)的要求。

2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

8 種生物胺的加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4 可知，8 種生物胺的加標(biāo)回收率范圍為95.31 %～105.22 %，其回收率的RSD 值均＜10 %，因此，該方法準(zhǔn)確可靠，可用于檢測(cè)黃酒中生物胺的種類(lèi)和含量。

表4 黃酒樣品中生物胺的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of recovery rate tests of biogenic amines in Chinese rice wine samples

2.4 黃酒發(fā)酵醪液中生物胺分析

在浙江紹興某黃酒廠(chǎng)采集7 個(gè)不同批次的黃酒發(fā)酵醪液進(jìn)行生物胺含量的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表5 所示。

由表5 可見(jiàn)，在黃酒發(fā)酵醪液中，8 種生物胺均能檢出，總生物胺的范圍是151.02 mg/L～181.48 mg/L，不同樣品之間總生物胺含量差異不大。這可能是因?yàn)辄S酒發(fā)酵醪液樣品是在同一酒廠(chǎng)的鄰近批次采集，由于生產(chǎn)環(huán)境和生產(chǎn)工藝較為固定，因此其生物胺總量較為接近。在所檢測(cè)的8 種生物胺中，黃酒中主要的生物胺為腐胺、酪胺，其中腐胺的含量范圍為75.52 mg/L～99.44 mg/L（占總生物胺的49.95%～54.79%），酪胺的含量范圍為52.74 mg/L～86.22 mg/L（占總生物胺的34.92%～48.48%），另外6 種生物胺含量較低（ND～7.05 mg/L）。這與食品中常見(jiàn)的微生物脫羧酶主要是酪氨酸脫氫酶和鳥(niǎo)氨酸脫氫酶一致[18]，其對(duì)應(yīng)的生物胺分別為酪胺和腐胺。

表5 黃酒發(fā)酵醪液中生物胺含量Table 5 Biogenic amine content in fermentated mash of yellow rice wine samples mg/L

3 結(jié)論

本文建立了黃酒發(fā)酵醪液中固液混合物生物胺的分析方法并測(cè)定了紹興某黃酒廠(chǎng)發(fā)酵醪液固液混合物的生物胺含量。8 種生物胺的檢出限為0.187 μg/L～0.35 μg/L，定量限為 0.323 μg/L～1.06 μg/L，且在0.5 μg/L～20 μg/L 范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。8 種生物胺在黃酒發(fā)酵醪液樣品中的平均回收率為95.31%～105.22%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.21%～9.87%，均小于10%，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中殘留檢測(cè)要求。該方法為黃酒發(fā)酵醪液（固液混合物）中生物胺的測(cè)定提供了簡(jiǎn)便可靠的方法。在黃酒發(fā)酵醪液中，8 種生物胺均能檢出，總生物胺的范圍是151.02 mg/L～181.48 mg/L。在所檢測(cè)的8 種生物胺中，黃酒中主要的生物胺為腐胺和酪胺。