內(nèi)蒙古烏海地區(qū)沙漠葡萄發(fā)酵醪液中釀酒酵母菌的篩選與鑒定

趙雪平，溫雅嬌，李正英，*，鄭海武，黃海英，李曉娟

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014109；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

釀酒酵母的分布與地理位置和氣候條件有關(guān)，目前世界大部分產(chǎn)區(qū)的釀酒酵母被廣泛研究[1-4]，我國葡萄產(chǎn)區(qū)的釀酒酵母也被廣泛關(guān)注，主要集中在寧夏、新疆、云南、山東等地。趙悅等對(duì)云南葡萄產(chǎn)區(qū)的釀酒酵母多樣性進(jìn)行了研究[5]，馬文瑞等在新疆產(chǎn)區(qū)篩選了高產(chǎn)酸釀酒酵母[6]，趙曉寧等對(duì)河北產(chǎn)區(qū)的釀酒酵母菌進(jìn)行了分析和鑒定[7]，張春芝等對(duì)寧夏產(chǎn)區(qū)的釀酒酵母菌進(jìn)行了鑒定[8]，而內(nèi)蒙古地區(qū)的釀酒酵母的篩選和分離，尚有大量的工作去做，內(nèi)蒙古烏海市位于北緯 39°02′～39°54′，東經(jīng) 106°36′～107°08′地處黃河上游，東臨鄂爾多斯高原，庫布奇沙漠、毛烏素沙漠和烏蘭布和沙漠，三大沙漠環(huán)繞烏海，光照充足，晝夜溫差大，為葡萄生長提供了很好的地理和環(huán)境條件，所產(chǎn)的葡萄的糖度大，故為酵母菌提供了良好的生長繁殖場所，因此期許在此地區(qū)能夠篩選出優(yōu)良的釀酒酵母菌。酵母菌在葡萄酒發(fā)酵過程中扮演著重要的角色，它分解葡萄汁中的大部分糖并轉(zhuǎn)化為酒精和二氧化碳。但還會(huì)生成一些其他的代謝產(chǎn)物，包括甘油、高級(jí)醇、酯、醛等，而這些影響了葡萄酒的色澤、香氣及口感，這些因素直接決定著葡萄酒的質(zhì)量[9]。優(yōu)良釀酒酵母菌的篩選不僅要考察釀酒酵母菌的發(fā)酵能力、耐受性，更重要的是產(chǎn)品的品質(zhì)。因此酵母菌的篩選對(duì)于葡萄酒品質(zhì)的提升具有很重要的意義。

本研究以內(nèi)蒙古烏海地區(qū)農(nóng)家自釀發(fā)酵醪液為篩選來源，對(duì)照商業(yè)菌株，通過發(fā)酵能力、耐受性、產(chǎn)酒精能力、低產(chǎn)硫化氫、產(chǎn)酯能力，分3 級(jí)進(jìn)行篩選，并且進(jìn)行鑒定及產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)。以期為我國葡萄酒的發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌種

測試菌種：采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)烏海農(nóng)家自釀發(fā)酵醪液。

對(duì)照菌種：葡萄酒活性干酵母（編號(hào)CECA）：安琪酵母股份有限公司；釀酒酵母（編號(hào)CSM）：法國拉曼公司。

1.1.2 原料

釀酒葡萄采于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技園區(qū)。

1.1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基：孟加拉紅0.033 g/L，氯霉素0.1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂15 g/L；

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）固體培養(yǎng)基：酵母浸出粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂 14 g/L，葡萄糖 20 g/L。

酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：酵母浸出粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。

氯化三苯基四氮唑（2，3，5，-triphenyltetrazolium，TTC）上層培養(yǎng)基[10]：TTC 0.5 g/L，葡萄糖 5 g/L，瓊脂15 g/L。

TTC 下層培養(yǎng)基[10]：硫酸鎂0.4 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L，酵母浸出粉1.5 g/L，蛋白胨2 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂20 g/L，調(diào)節(jié)pH 值至5.5。

BIGGY 瓊脂培養(yǎng)基：BIGGY 瓊脂 45 g/L。

產(chǎn)酯固體培養(yǎng)基[11-12]：溴甲酚紫0.04 g/L，三丁酸甘油脂15 mL/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂 20 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：硫酸銨1 g/L，硫酸鎂1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，酵母浸粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖200 g/L。

1.1.4 主要試劑

酵母浸粉、胰蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；瓊酯粉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀：天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司；硫酸銨：天津市天大化學(xué)試劑廠；硫酸鎂：北京雙環(huán)化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；乳酸：天津市化學(xué)試劑三廠；乳酸鉀：山東優(yōu)索化工科技有限公司；酒石酸鉀鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母菌DNA 提取試劑盒：天根生化科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.1.5 儀器與設(shè)備

全功能酶標(biāo)儀（synergyHIMF+Take3）：美國BioTek儀器有限公司；電子天平（TP-214）、酸度計(jì)（PHS-3C）、移液器（1 00 μL～1 000 μL）：丹佛儀器北京有限公司；可調(diào)式封閉電爐（FL-2）：天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫震蕩培養(yǎng)箱（THZ-98AB）、生化培養(yǎng)箱（LRH-70）、光學(xué)顯微鏡（CX21）、電熱恒溫水浴鍋（HWS12）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（SX-700）：北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（VD-1320）：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；高速離心機(jī)（HC-2518R）：海玉博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母菌株的分離純化

以內(nèi)蒙古烏海地區(qū)農(nóng)家自釀發(fā)酵醪液為酵母菌的收集來源。將收集的樣品制成菌液，并且稀釋，吸取50 μL 稀釋后的菌液于孟加拉紅固體平板上，用涂布棒涂勻，28 ℃培養(yǎng)1 d～3 d。挑選單個(gè)的具有典型酵母菌菌落特征且形態(tài)差異較為明顯的菌落，劃線純化兩到三代，將上述分離純化得到的酵母菌接入YEPD 斜面培養(yǎng)基，4 ℃保藏。

1.2.2 釀酒酵母菌株一級(jí)篩選

采用酵母菌株發(fā)酵力試驗(yàn)進(jìn)行一級(jí)篩選。將分離純化得到的酵母菌株活化，接入放有倒置杜氏管的YPD 液體培養(yǎng)基試管中，28 ℃培養(yǎng)，每隔12 h 觀察其產(chǎn)氣情況，記錄杜氏管內(nèi)氣體體積[10]。去除發(fā)酵速度慢，不產(chǎn)氣的菌株。將起酵速度快，產(chǎn)氣多的菌株篩選出來，并用于二級(jí)篩選。

1.2.3 釀酒酵母菌株二級(jí)篩選

采用耐受性測定進(jìn)行二級(jí)篩選，包括耐酒精性能試驗(yàn)、耐SO2性能試驗(yàn)、高糖耐受性試驗(yàn)和低pH 值的耐受性試驗(yàn)，將YPD 液體培養(yǎng)基分裝到試管中再放入倒置的杜氏管，杜氏管內(nèi)不含空氣。121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫（25 ℃），按照表1 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基條件梯度，酒精度和SO2濃度先滅菌后調(diào)整，糖度和pH 值先調(diào)整后滅菌。接種待測酵母菌株接2%，每個(gè)處理平行3 次，28 ℃培養(yǎng)1 d～3 d，觀察其產(chǎn)氣狀況判斷其耐受性。以商業(yè)釀酒酵母CECA 和CSM 及空白試驗(yàn)作為對(duì)照。酵母菌株耐受性測定條件梯度設(shè)置見表1。

表1 酵母菌株耐受性測定條件梯度Table 1 Conditional gradient for tolerance measurement of yeast strains

1.2.4 釀酒酵母菌株三級(jí)篩選

將分離后的酵母菌株利用TTC 培養(yǎng)基顯色法測定菌株產(chǎn)酒精能力，BIGGY 瓊脂培養(yǎng)基顯色法測定菌株產(chǎn)硫化氫性以及產(chǎn)酯培養(yǎng)基顯色法測定菌株產(chǎn)酯特性。篩選出產(chǎn)酒精能力強(qiáng)、低產(chǎn)硫化氫且高產(chǎn)酯的優(yōu)良酵母菌株。

1.2.4.1 高產(chǎn)酒精酵母菌株的篩選

酵母菌株劃線接種到TTC 下層培養(yǎng)基上，以商業(yè)釀酒酵母CECA 和CSM 及空白試驗(yàn)作為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)1 d～3 d 后，在菌落上覆蓋一層TTC 上層培養(yǎng)基，28 ℃遮光培養(yǎng)。觀察各平皿中菌落的顯色情況，菌株與培養(yǎng)基反應(yīng)，使菌落呈現(xiàn)白色、淺紅色、紅色和深紅色，菌落呈現(xiàn)的顏色越深，表明菌株產(chǎn)酒精能力越強(qiáng)。

1.2.4.2 低產(chǎn)硫化氫酵母菌株的篩選

將1.2.4.1 中篩選出的高產(chǎn)酒精酵母菌株點(diǎn)種到BIGGY 瓊酯培養(yǎng)基上，并以商業(yè)釀酒酵母CECA 和CSM 及空白試驗(yàn)作為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)1 d～3 d，觀察各菌株菌落顏色，菌株產(chǎn)生的硫化氫與BIGGY 培養(yǎng)基中的鉍發(fā)生反應(yīng)，使菌落呈現(xiàn)白色、黃色、淺棕色和深棕色，顏色越深，代表菌株產(chǎn)硫化氫的量越多。

1.2.4.3 高產(chǎn)酯酵母菌株的篩選

將1.2.4.2 中篩選出的酵母菌株劃線接種到產(chǎn)酯培養(yǎng)基上，以商業(yè)釀酒酵母CECA 和CSM 及空白試驗(yàn)作為對(duì)照。觀察其菌落顏色。菌株產(chǎn)酯能力不同所呈現(xiàn)在產(chǎn)酯平板上的菌落顏色也不相同，菌落黃色越濃，表明菌株的產(chǎn)酯量越多[13]。

1.2.5 優(yōu)良菌株的分子生物學(xué)鑒定

酵母菌株KT3 送至生工生物工程（上海）股份有限公司，進(jìn)行26S rDNA D1/D2 區(qū)測序[14-16]，酵母菌株序列測定后，將測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，通過比對(duì)測序菌株與數(shù)據(jù)庫中模式菌株的可信值進(jìn)行鑒定，用Mega 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.6 優(yōu)良酵母菌發(fā)酵特性的測定

將優(yōu)良酵母菌株按2%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，每組試驗(yàn)3 個(gè)平行，并以商業(yè)釀酒酵母CECA 和CSM 及空白試驗(yàn)作為對(duì)照。在130 r/min，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔12 h 稱重并記錄。計(jì)算出菌株的CO2失重量，判斷菌株的發(fā)酵速率。

將優(yōu)良菌株接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)。每隔2 h 測定菌液的OD600值，連測16 次，根據(jù)OD值繪制其生長曲線，確定其生長對(duì)數(shù)期。

1.2.7 酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的優(yōu)良菌株接種到Y(jié)PD 液體培養(yǎng)基中，在10 ℃、12 000 r/min 條件下離心3 min，收集菌泥備用[17]。選用種植于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技園區(qū)的葡萄進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)[葡萄汁理化指標(biāo)為：23.0 Brix°，還原糖 154.07 g/L，總酸（6.86±0.2）g/L，pH 值3.14]。葡萄汁中按2%的接種量接入優(yōu)良酵母菌株，同時(shí)用法國商業(yè)酵母CSM 和國產(chǎn)商業(yè)酵母CECA 作對(duì)照。在25 ℃下恒溫發(fā)酵。每24h 測定還原糖、總酸和酒精度，當(dāng)殘?zhí)呛肯陆抵? g/L 以下時(shí)視為發(fā)酵結(jié)束[18-19]，按照 GB/T 15037-2006《葡萄酒》[18]的方法，組織7 位有經(jīng)驗(yàn)的品評(píng)員，進(jìn)行感官評(píng)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母菌的分離純化

將發(fā)酵醪液中酵母菌的分離純化，通過對(duì)酵母菌形態(tài)觀察以及顯微鏡鏡檢，初步去除重復(fù)菌株，共篩選 出 22 株 酵 母 菌 株 編 號(hào) 為 ：KC1 ～KC4、KS1 ～KS3、KP1～KP6、KJ1～KJ3、KT1～KT3、KZ1～KZ3。

2.2 釀酒酵母菌的篩選

2.2.1 釀酒酵母菌的一級(jí)篩選

將分離純化的22 株酵母菌進(jìn)行酵母菌發(fā)酵能力測定，測定結(jié)果見表2。

表2 酵母菌株發(fā)酵力測定結(jié)果Table 2 Determination of fermentation ability of yeast strains

由表2 可知，分離純化的22 株酵母菌株經(jīng)過杜氏管產(chǎn)氣試驗(yàn)，有10 株菌能在12 h 內(nèi)（包括12 h）發(fā)酵產(chǎn)生CO2，并充滿杜氏管，說明這部分菌株的發(fā)酵能力最強(qiáng)，活力最旺盛；有9 株酵母菌能在24 h 內(nèi)（包括24 h）起酵并產(chǎn)氣充滿杜氏管，說明這些菌株的生長速度較快，能夠在短時(shí)間內(nèi)開始發(fā)酵；有3 株酵母菌未在48 h 內(nèi)產(chǎn)氣，說明其生長繁殖慢，發(fā)酵力弱。葡萄酒的生產(chǎn)釀造中，葡萄原汁并不經(jīng)過消毒殺菌，若持續(xù)48 h都無法開始發(fā)酵，就會(huì)導(dǎo)致葡萄汁變質(zhì)，影響口感和酒的品質(zhì)，所以將未在48 h 內(nèi)產(chǎn)氣的菌株淘汰，僅保留余下的19 株菌進(jìn)行二級(jí)篩選試驗(yàn)。

2.2.2 釀酒酵母菌耐受性測定

將一級(jí)篩選得到得19 株菌進(jìn)行耐受性測定，結(jié)果見表3。

國標(biāo)GB 2760-2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[20]要求葡萄酒生產(chǎn)中SO2最大添加量不超過250 mg/L，釀制干紅葡萄酒的葡萄含糖量一般大于20%壓榨后的冰葡萄汁含糖量能達(dá)到35%～45%[21]，新鮮葡萄汁的pH 值范圍在3～4.5 之間，本研究中的19 株酵母菌均符合釀酒酵母耐受性的要求。

表3 酵母菌株耐受性能測定試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Screening results of ester-producing characteristics

2.2.3 高產(chǎn)酒精酵母菌的篩選

將分離純化的19 株酵母菌進(jìn)行產(chǎn)酒精能力試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 酵母菌在TTC 培養(yǎng)基上的顯色結(jié)果Table 4 Chromogenic results of yeast on TTC medium

由表4 可知，有 8 株酵母菌（KT2、KT3、KS3、KP4、KP6、KJ2、KZ1、KZ3） 的菌落在 TTC 培養(yǎng)基上呈深紅色，其產(chǎn)酒精能力與對(duì)照組相當(dāng)，因此選擇這8 株產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母菌進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。

2.2.4 低產(chǎn)硫化氫酵母菌株的篩選試驗(yàn)

將高產(chǎn)酒精的8 株酵母菌進(jìn)行低產(chǎn)硫化氫酵母菌株的篩選試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5 酵母菌在BIGGY 培養(yǎng)基上菌落顏色Table 5 Colony colour of yeast on BIGGY medium

BIGGY 瓊脂是一種具有選擇性的培養(yǎng)基，使用鉍作為指示劑，來測定菌株生長時(shí)是否有產(chǎn)生硫化氫，顏色越深，表面菌株產(chǎn)硫化氫越多[22]。由表5 可知，對(duì)照菌株CECA 菌落在BIGGY 培養(yǎng)基上呈淺棕褐色，為低產(chǎn)硫化氫酵母，CSM 呈棕褐色，為中產(chǎn)硫化氫酵母。硫化氫產(chǎn)生的不良?xì)馕稌?huì)影響葡萄酒的風(fēng)味[23]，且對(duì)人體有毒害作用，基于此，僅保留低產(chǎn)和中產(chǎn)硫化氫的菌株KP3、KJ2 和KT3 作后續(xù)研究。

2.2.5 高產(chǎn)酯酵母菌株的篩選試驗(yàn)結(jié)果

將3 株低中產(chǎn)硫化氫高產(chǎn)酒精酵母分別接種到產(chǎn)酯培養(yǎng)基上，并以商業(yè)菌株CECA 和CSM 作對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d～3 d。觀察菌落附近的顏色并記錄，顯色結(jié)果見表6。

由表6 可知，對(duì)照菌株CECA、CSM 及KT3 的菌落在產(chǎn)酯培養(yǎng)基上呈深黃色，即產(chǎn)酯能力較強(qiáng)，選擇KT3 酵母菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 優(yōu)良酵母菌的鑒定

酵母菌株KT3 的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）擴(kuò)增電泳圖如圖1。

表6 產(chǎn)酯特性篩選結(jié)果Table 6 Screening results of ester-producing characteristics

圖1 酵母菌株P(guān)CR 擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplified electrophoresis map of yeast strains

如圖1 所示，通過對(duì)酵母菌株DNA 的提取和PCR擴(kuò)增，可以看出酵母菌株的DNA 片段長度在580 bp～600 bp 左右，符合前人對(duì)酵母菌基因序列長度的研究范圍[24]。

DNA 測序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行序列同源性比對(duì)，結(jié)果見表7。

通過比較得到酵母菌株KT3 的DNA 片段與釀酒酵母同源性最高，達(dá)到99%，與測序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，并用MEGA6.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖2。最終確定酵母菌株KT3 為釀酒酵母。

表7 酵母菌株26S rDNA D1/D2 序列測序結(jié)果Table 7 Sequencing results of 26S rDNA D1/D2 sequence of yeast strain

2.4 優(yōu)良酵母菌發(fā)酵特性測定

釀酒酵母菌株KT3 生長曲線如圖3 所示。

圖3 可以看出，在2 h～4 h 內(nèi)，菌株處于調(diào)整期，菌株繁殖較慢；4 h～12 h，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期；培養(yǎng)到12 h～30 h 時(shí)，菌株進(jìn)入穩(wěn)定期；在 30 h～36 h 時(shí)，菌株活力下降逐漸進(jìn)入衰亡期。綜上可知該釀酒酵母菌具有良好的生長特性。

酵母菌株KT3 的發(fā)酵速率測定結(jié)果見圖4。

由圖4 可知，菌株KT3 的發(fā)酵液CO2失重略小于對(duì)照菌株CECA 發(fā)酵液的CO2失重，大于對(duì)照菌株CSM 發(fā)酵液CO2失重，具有良好的發(fā)酵速率。

2.5 酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)

優(yōu)選的釀酒酵母和2 株商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵的葡萄酒的色澤、香氣、澄清度、滋味、典型性等方面進(jìn)行評(píng)分[25-26]，結(jié)果見表8 和圖5。

圖2 酵母菌株26S rDNA 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by yeast strain 26S rDNA

圖3 KT3 生長曲線圖Fig.3 OD600 value of growth curve of KT3

圖4 CO2 失重Fig.4 CO2 weight loss

表8 不同酵母菌發(fā)酵的干紅葡萄酒感官評(píng)分表Table 8 Sensory scoring scale for dry red wine fermented by different yeasts

圖5 不同酵母菌發(fā)酵的干紅葡萄酒感官評(píng)定Fig.5 Sensory scoring scale for dry red wine fermented by different yeasts

在2 株商業(yè)酵母菌和1 株優(yōu)選酵母菌發(fā)酵葡萄酒的感官評(píng)分中，評(píng)分從高到低依次為CECA、KT3、CSM。篩選出的優(yōu)良菌株中KT3 釀制的葡萄酒酒體澄清透亮有光澤，呈寶石紅色，入口偏酸，口味獨(dú)特，層次豐富，有典型性。

3 結(jié)論

本文以內(nèi)蒙古烏海地區(qū)自然發(fā)酵醪液為篩選來源，通過篩選得到1 株酵母菌KT3，經(jīng)26S rDNA D1/D2 區(qū)域測序，確定KT3 為釀酒酵母菌，該酵母菌的耐酒精度為16%，耐SO2濃度為450 mg/L，耐高糖濃度為50%，耐pH 值為2.5，具有良好的耐受性，產(chǎn)品典型性突出，可以用于商業(yè)化生產(chǎn)。