超聲波輔助酶法提取青魚魚皮膠原蛋白工藝

王正云，蔣慧亮

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300）

膠原蛋白是動(dòng)物結(jié)締組織中的主要成分，占哺乳動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的25%～30%，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用[1]。近年來，魚類產(chǎn)品的下腳料被大量丟棄，不利于環(huán)境保護(hù)并且會(huì)造成資源的浪費(fèi)。

青魚（black carp）又名黑鯇、螺螄青，屬鯉形目、鯉科的雅羅魚亞科。主要分布于我國長江以南的平原地區(qū)，是長江中、下游和沿江湖泊里的重要漁業(yè)資源，2014 年全國養(yǎng)殖產(chǎn)量約為55.7 萬噸，為我國淡水養(yǎng)殖的“四大家魚”之一，青魚魚皮中含有豐富的膠原蛋白。

現(xiàn)有資料表明，酶法提取對(duì)膠原蛋白破壞性小，能更好、更完全地得到活性蛋白[2]。常用的酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等，具有反應(yīng)快、時(shí)間短、無污染等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)超聲波提取因污染小、節(jié)能、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，已在當(dāng)今生產(chǎn)、生活和科研等諸多領(lǐng)域被廣泛使用，在生物活性物質(zhì)提取中具有良好的應(yīng)用前景[3-4]。

目前國內(nèi)外對(duì)青魚魚下腳料魚皮研究很少，對(duì)超聲波輔助提取青魚魚皮膠原蛋白工藝未見報(bào)道，本研究以青魚魚皮為原料，在超聲波輔助作用下，研究膠原蛋白的酶法提取工藝條件，為膠原蛋白相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青魚：市購；胰蛋白酶（250 U/g）、L-羥脯氨酸：上海潤成生物科技有限公司；對(duì)二甲基氨基苯甲醛、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、氯化鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

754 紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；TDL-40B 臺(tái)式低速大容量離心機(jī)：金壇市金南儀器制造有限公司；EL20K 酸度計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；SHNS-SY-1000 超聲波提取器：北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 膠原蛋白提取工藝流程

青魚魚皮的制備→NaOH 脫雜蛋白和脫色→正己烷去脂→水洗→超聲波輔助酶提取→滅酶→離心→膠原蛋白提取液[5]

1.3.2 膠原蛋白提取操作要點(diǎn)

1.3.2.1 青魚魚皮的制備

將活青魚去頭、去內(nèi)臟，對(duì)剖成兩片后將魚皮與魚肉分離。將分離得到的魚皮去鱗、去鰭，清水沖洗干凈，陰涼處自然晾干，然后用剪刀將干凈的魚皮剪成碎片（5 mm×5 mm），放入密封袋封口后于-20 ℃凍藏備用。

1.3.2.2 青魚魚皮預(yù)處理

在4 ℃冰箱貯存條件下，用0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡魚皮1 h 用來脫雜蛋白和脫色，用蒸餾水清洗后，在同樣溫度條件下再用2 倍體積的正己烷浸泡魚皮6 h 以去除脂肪，取出清洗后備用。

1.3.2.3 青魚魚皮膠原蛋白的提取

取預(yù)處理好的青魚魚皮，加入料液比為1∶20（g/mL）的一定pH 值的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行浸泡溶脹，溶脹12 h 進(jìn)行勻漿，加入適量的胰蛋白酶溶液，放入一定功率的超聲波中處理一定時(shí)間，然后放入恒溫水浴鍋在35 ℃進(jìn)行酶解提取，最后在100 ℃條件下滅酶10 min，冷卻后在4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液測(cè)定青魚魚皮膠原蛋白提取率[6-7]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以膠原蛋白的提取率為目標(biāo)參數(shù)，每組用量為5 g，以加酶量、超聲波處理時(shí)間、超聲波功率、酶解溫度、pH 值、酶解時(shí)間6 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每個(gè)水平平行測(cè)定3 次取其平均值。

1.3.3.1 超聲波功率對(duì)膠原蛋白提取率的影響

在超聲波處理時(shí)間50 min、加酶量100 U/g、酶解溫度35 ℃、pH 7.5、酶解時(shí)間6 h 的條件下提取膠原蛋白，設(shè)置超聲波功率分別為 300、400、500、600、700、800 W，研究超聲波功率對(duì)膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.3.2 超聲波處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

在超聲波功率600 W、加酶量100 U/g、酶解溫度35 ℃、pH 7.5、酶解時(shí)間6 h 的條件下提取膠原蛋白，設(shè)置超聲波處理時(shí)間分別為 10、20、30、40、50、60 min，研究超聲波處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.3.3 加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

在超聲波功率600 W、超聲波處理時(shí)間50 min、酶解溫度35 ℃、pH 7.5、酶解時(shí)間6 h 的條件下提取膠原蛋白，設(shè)置加酶量分別為 40、60、80、100、120、140 U/g，研究加酶量對(duì)膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.3.4 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

在超聲波功率600 W、超聲波處理時(shí)間50 min、加酶量100 U/g、pH=7.5、酶解時(shí)間6 h 的條件下提取膠原蛋白，設(shè)置酶解溫度分別為 25、30、35、40、45、50 ℃，研究酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.3.5 酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

在超聲波功率600 W、超聲波處理時(shí)間50 min、加酶量100 U/g、酶解溫度35 ℃、pH 7.5 的條件下提取膠原蛋白，設(shè)置酶解時(shí)間分別為 3、4、5、6、7、8 h，研究酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.3.6 pH 值對(duì)膠原蛋白提取率的影響

在超聲波功率600 W、超聲波處理時(shí)間50 min、加酶量 100 U/g、pH 7.5、酶解溫度 35 ℃、酶解時(shí)間 6 h 的條件下提取膠原蛋白，設(shè)置pH 值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，研究pH 值對(duì)膠原蛋白提取效果的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取加酶量、酶解溫度、pH值、超聲波處理時(shí)間4 個(gè)因素為考察因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table in orthogonal experiment

1.3.5 魚皮膠原蛋白提取率的測(cè)定

羥脯氨酸為膠原蛋白特有氨基酸，通過測(cè)定提取液中羥脯氨酸的含量計(jì)算出魚皮膠原蛋白提取率。羥脯氨酸的測(cè)定參考國標(biāo)：GB/T9695.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定》[8]。羥脯氨酸得率公式如下。

式中：W 為樣品中羥脯氨酸得率，%；C 為羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度，μg/mL；V 為提取液總體積，mL；f 為稀釋倍數(shù)；m1為原料質(zhì)量，g；n 為換算系數(shù)（取0.1）。

青魚魚皮蛋白質(zhì)含量測(cè)定參考國標(biāo)GB5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的第一法凱氏定氮法[9]。青魚魚皮膠原蛋白提取率計(jì)算公式如下。

式中：X 為魚皮膠原蛋白提取率，%；w 為羥脯氨酸含量，g；11.1 為羥脯氨酸換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；m2為魚皮蛋白質(zhì)含量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲波功率對(duì)膠原蛋白提取率的影響

超聲波功率對(duì)膠原蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 超聲波功率對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on collagen extraction yield

由圖1 可知，當(dāng)超聲波功率為300 W～600 W 之間時(shí)，膠原蛋白提取率與超聲波功率呈正相關(guān)，隨著超聲波功率的提高，大量溶劑滲透到細(xì)胞中，從而提高提取率。當(dāng)超聲波功率達(dá)到600 W 時(shí)膠原蛋白提取率達(dá)到最高值。此后，提取率隨著超聲波功率的上升反而降低。這可能是由于功率過大的超聲波破壞了魚皮膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致膠原蛋白提取率下降[10-11]，因此本試驗(yàn)條件下超聲波功率為600 W 時(shí)最佳。

2.1.2 超聲波處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

超聲波處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 超聲波處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of supersonic extraction time on collagen extraction yield

由圖2 可知，隨著超聲波處理時(shí)間的延長，提取率不斷增大，當(dāng)超過50 min 時(shí)，提取率幾乎不變。表明基本溶出全部膠原蛋白，但超聲波處理時(shí)間過長可能會(huì)造成體系溫度過高而降低酶的活性或破壞膠原蛋白的結(jié)構(gòu)[12-13]。因此，初步選擇超聲波提取時(shí)間為40 min～50 min。

2.1.3 加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of amount of enzyme on collagen extraction yield

如圖3 所示，剛開始時(shí)膠原蛋白提取率隨著酶的加入量增大而顯著增大，幾乎呈線性關(guān)系，當(dāng)加酶量超過100 U/g 之后，提取率略有下降。這可能是魚皮中膠原蛋白與酶結(jié)合已達(dá)到飽和，再增加酶用量時(shí)不再提高膠原蛋白提取率，甚至可能導(dǎo)致膠原蛋白降解而使提取率下降[14-15]。同時(shí)考慮到成本，酶用量選擇在80 U/g～120 U/g 為宜。

2.1.4 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of enzyme extraction temperature on collagen extraction yield

由圖4 可知，酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率具有雙重影響[16-17]，剛開始時(shí)隨著酶解溫度的提高，膠原蛋白提取率不斷上升，在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值，但當(dāng)酶解溫度繼續(xù)升高進(jìn)行提取時(shí)，提取率直線下降，說明酶解溫度為30 ℃～40 ℃為胰蛋白酶的最適溫度范圍，超過此溫度酶活性會(huì)受到抑制，而降低膠原蛋白的提取率。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.5 Effects of amount of enzyme extraction time on collagen extraction yield

由圖5 可知，在酶解提取初期的4 h 內(nèi)，膠原蛋白提取率較低，膠原蛋白還未充分溶于提取液中，隨后隨著酶解時(shí)間的延長，膠原蛋白提取率逐漸增加，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到6 h 時(shí)，膠原蛋白提取率達(dá)到最大值，此后提取率幾乎不再增加，說明膠原蛋白已基本提取完全，因此酶解時(shí)間在6 h 時(shí)膠原蛋白的提取效果最佳。

2.1.6 pH 值對(duì)膠原蛋白提取率的影響

pH 值對(duì)膠原蛋白提取率的影響見圖6。

由圖6 可知，在pH 值為7～8 時(shí)膠原蛋白提取率為最佳，低于或高于此pH 值范圍，膠原蛋白提取率均不理想，與胰蛋白酶活性酸度范圍一致。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

基于單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖6 pH 值對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.6 Effects of pH on collagen extraction yield

表2 正交分析結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal analysis

采用L9（34）正交試驗(yàn)確定青魚魚皮膠原蛋白的超聲波輔助酶提取最佳工藝[18-20]，由表2 極差分析可以看出：加酶量（A）、pH 值（B）、酶解溫度（C）、超聲波處理時(shí)間（D）4 個(gè)因素對(duì)魚皮膠原蛋白提取率影響的主次關(guān)系C＞D＞A＞B，即影響因素酶解溫度＞超聲波處理時(shí)間＞加酶量＞pH 值。最佳提取工藝為即A2B2C3D3，即加酶量100 U/g、pH 7.5、酶解溫度40 ℃、超聲波處理時(shí)間50 min，在最優(yōu)條件下進(jìn)行進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得膠原蛋白提取率為45.3%。

應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)正交分析結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 ANOVA analysis of orthogonal results

續(xù)表3 正交試驗(yàn)方差分析Continue table 3 ANOVA analysis of orthogonal results

由表3 可知，在影響膠原蛋白提取率的4 個(gè)因素中，酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率影響極顯著，加酶量和超聲波處理時(shí)間影響顯著，pH 值影響不顯著，與正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

通過對(duì)各因素進(jìn)行極差和方差分析表明：酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率為極顯著，加酶量及超聲波處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率高度顯著，pH 值對(duì)膠原蛋白提取率影響不顯著，各因素對(duì)膠原蛋白提取率影響大小依次為酶解溫度＞超聲波處理時(shí)間＞加酶量＞pH 值。通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到超聲波輔助酶提取青魚魚皮中膠原蛋白最優(yōu)提取條件為加酶量100 U/g、pH 7.5、酶解溫度40 ℃、超聲波處理時(shí)間50 min。在此條件下膠原蛋白提取率為45.3%。