殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜的制備與表征

姜雪，段蕾，韓墨，吳修利，殷立穎

（長春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130022）

近年來，大量石化塑料的使用帶來了自然資源枯竭、食品安全和環(huán)境污染等系列問題，生物降解和生物基包裝材料受到了廣泛關(guān)注[1]。天然高分子聚合物，如淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)和殼聚糖等作為可生物降解和食用的物質(zhì)，由于具有良好的安全性、生物相容性、可降解和成膜等特性，具有廣泛的應(yīng)用前景[2]。此外，大量的研究也集中于添加天然抗氧化劑和抗菌劑食用包裝材料[3]。

殼聚糖是由自然界中存儲量僅次于纖維素的天然高聚物甲殼素脫乙酰所得到的產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)單元為β-1，4-2-氨基-D-葡萄糖。作為一種優(yōu)良的成膜材料，殼聚糖與許多中等強(qiáng)度的商用高分子材料相比具有良好的透氣性和力學(xué)性能，人們普遍認(rèn)為酵母和霉菌對殼聚糖最敏感，其次是革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌[4]。但殼聚糖抑菌譜較窄的缺點(diǎn)限制了其作為食品活性包裝的應(yīng)用范圍[5]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，在殼聚糖膜中添加香芹酚、綠茶和葡萄籽提取物等含有多酚類抗氧化生物活性物質(zhì)有助于食品保鮮和延長保質(zhì)期[3，6]。

酸棗仁作為藥食同源的原料，含有黃酮類、萜類、皂苷及有機(jī)酸等多種活性成分，其中黃酮類為主要的有效成分。黃酮類化合物具有抗氧化、抗病毒及非常廣泛的抑菌作用[7-9]，對于多種細(xì)菌具有抑制作用，抑菌效果甚至優(yōu)于多酚類化合物[10]。因此本文將酸棗仁總黃酮與殼聚糖復(fù)合成膜，提高殼聚糖復(fù)合膜的抗菌活性和抗氧化性，從而拓寬殼聚糖膜在食品活性包裝方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（脫乙酰度為84%）；甘油：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；氫氧化鈉、冰乙酸、氯化鈉（分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AM-3250A 型磁力攪拌機(jī)：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；DZF-6050 型真空干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；721-100 型可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；KQ-600KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；QJ210 型電子萬能儀試驗機(jī)：上海傾技儀器儀表科技有限公司；NICOLETIS5 型傅里葉紅外儀：賽默飛世爾科技有限公司；JSM-6510LA 型掃描電子顯微鏡：日本島津公司；TD-3000 型X-射線衍射儀：丹東通達(dá)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸棗仁總黃酮提取

酸棗仁總黃酮提取依據(jù)先前的研究[11]，將脫脂后的酸棗仁粉末 1.0 g 按料液比 1 ∶57（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)74%，加入聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中，密封置于干燥箱中，設(shè)定提取溫度93 ℃、提取時間4.2 h，在此條件下，提取3 次，然后冷卻至室溫25 ℃，取出反應(yīng)釜，抽濾提取液，即得到分析液。采用NaNO2-Al（NO3）3比色法檢測酸棗仁總黃酮得率為16.761 mg/g，黃酮濃度為1.085 mg/mL。

1.3.2 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜的制備

1.0 g 殼聚糖溶于35 mL 2%的乙酸溶液中，攪拌均勻后，加入0.3 g 甘油，50 ℃水浴保溫30 min，并持續(xù)攪拌制得殼聚糖溶液；而后將制備的黃酮提取液分別按 0、5、10、15 mL 加入到殼聚糖溶液中，50 ℃攪拌30 min，室溫25 ℃下，超聲20 min，除去殼聚糖復(fù)合膜膜液中的氣泡；稱取22 g 殼聚糖復(fù)合膜膜液流延在直徑為10.2 cm 的塑料平板上，50 ℃烘干揭膜。

1.3.3 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜物理性能的測定

1.3.3.1 復(fù)合膜的厚度和密度

復(fù)合膜厚度使用數(shù)顯型螺旋測微器進(jìn)行測量。在膜上任意測量5 個位置，每個樣本測量5 次，計算平均值。膜密度由膜重量和體積確定，膜體積由膜面積和厚度進(jìn)行計算。

1.3.3.2 復(fù)合膜透明度

透明度的測定參考Park 等[12]方法，略有改動。選取光滑、平整、潔凈且無瑕疵的膜，將試樣膜（1 cm×4 cm樣條）置于紫外分光光度計中，在600 nm 處測定試樣膜的吸光度。未放置膜的單元作為參照樣。試樣膜的透明度以不透明度表示，計算公式如下：

式中：O 表示不透明度；Abs 為試樣在 600 nm 的吸光度；d 為試樣的厚度，mm。

1.3.4 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜機(jī)械性能的測定

測試方法參照GB13022-91《塑料、薄膜拉伸性能試驗》略有改動，將膜樣品裁成長條型的試樣（長150 mm×寬10 mm），作出標(biāo)距50 mm，在相對濕度為75%的干燥器內(nèi)平衡48 h。測試條件：試驗拉伸速率設(shè)定為100 mm/min，夾具間距為50 mm，室溫25 ℃條件下測定。

1.3.5 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜結(jié)構(gòu)表征

1.3.5.1 傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（fourier transform attenuated total reflection infrared spectrometry，ATR-FTIR）[13]

利用紅外光譜儀進(jìn)行掃描，并采用薄膜法，紅外掃描范圍波長范圍為4 000 cm-1～650 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為 16 次。

1.3.5.2 X-射線衍射分析（X-ray diffraction，XRD）[14]

采用X-射線衍射儀對復(fù)合膜晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，銅靶，入射線波長0.154 2 nm，Ni 濾波片，管壓40 kV，管流40 mA，掃描角度 2θ 為 5°～40°，掃描速度為 2 °/min。

1.3.5.3 掃描電鏡分析（scanning electron microscope，SEM）

將膜樣用導(dǎo)電膠固定在銅臺，然后噴鍍上金箔，采用高倍掃描電子顯微鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5 軟件繪圖，Spss 17.0 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜物理性能分析

酸棗仁黃酮添加量對殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜的膜厚度、密度、透明度的影響見表1。

表1 不同添加量的酸棗仁黃酮/殼聚糖復(fù)合膜的特性研究Table 1 Properties of chitosan film incorporated with different jujube flavonoid

從表1 中數(shù)據(jù)可以看出，隨著酸棗仁黃酮提取物添加的增加復(fù)合膜厚度及密度呈現(xiàn)增大的趨勢。同樣的現(xiàn)象也發(fā)生在蘋果幼果多酚殼聚糖復(fù)合膜性質(zhì)研究中，研究者認(rèn)為多酚可能在殼聚糖鏈羥基之間起到架橋的作用，因此殼聚糖分子之間的距離變短，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)更緊密，增大了膜厚度和膜密度[1]。

隨著酸棗仁黃酮提取物的加入使復(fù)合膜趨向于黃色，而且較暗，膜不透明度O 值從1.570 增加到1.995，可見復(fù)合膜透明度下降。包裝材料透明度的降低可以有效的避免包裝食品受到可見光和紫外光的作用發(fā)生氧化變質(zhì)及氣味流失[15]。

2.2 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜機(jī)械性能

抗拉強(qiáng)度是薄膜抵抗施加的拉伸應(yīng)力而顯示的最大強(qiáng)度，而斷裂伸長率則代表薄膜斷裂前試樣長度的最大變化。酸棗仁黃酮添加量對殼聚糖復(fù)合膜力學(xué)性能影響見圖1。

圖1 殼聚糖復(fù)合膜抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率Fig.1 Tensile strength and elongation at break of chitosan composite film

隨著酸棗仁黃酮量的增加，拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率都呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，其中以殼聚糖空白膜的拉伸強(qiáng)度最大，隨著酸棗仁黃酮提取液的加入，拉伸強(qiáng)度逐漸將小，當(dāng)添加15 mL 時，拉伸強(qiáng)度最低，僅僅是空白膜的1/4 左右，從膜的柔韌性來看，也是殼聚糖空白膜最好。在研究殼聚糖/佛手柑精油膜和殼聚糖/茶提取液膜力學(xué)特性的過程也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律[16]。殼聚糖膜的力學(xué)特性與殼聚糖的組成、膜微觀網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和分子間的作用力有關(guān)。酸棗仁黃酮提取液添加到殼聚糖膜中，黃酮分子破壞了殼聚糖分子規(guī)整性，減弱了殼聚糖分子間的氫鍵，阻礙了高分子鏈間的相互作用，因而殼聚糖復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度降低[17]。而另外一個原因也可能是殼聚糖膜溶液加入酸棗仁黃酮后，導(dǎo)致制備的膜發(fā)生不連續(xù)性，進(jìn)而膜的柔韌性降低，抗壓能力下降[15]。

2.3 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜紅外光譜分析

不同酸棗仁黃酮添加量的殼聚糖復(fù)合膜紅外光譜如圖2 所示。

圖2 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of chitosan/jujube flavonoid composite film

由圖2 可知，殼聚糖空白復(fù)合膜紅外譜圖各吸收峰歸屬如下[18-20]，位于波數(shù) 3 500 cm-1～3 200 cm-1的寬峰源自殼聚糖膜中氫鍵締合的-OH 伸縮振動與氨基基團(tuán)的N-H 伸縮振動所疊加的多重吸收峰。2 920 cm-1和2 860 cm-1附近的吸收峰歸屬于C-H 的伸縮振動，而位于波數(shù) 1 650、1 556 cm-1和 1 310 cm-1的吸收峰則分別對應(yīng)于酰胺Ⅰ譜帶、酰胺Ⅱ譜帶、酰胺Ⅲ譜帶。此外，紅外譜圖上還可觀測到位于1 157 cm-1的CO-C 鍵的伸縮振動，1 017 cm-1位置附近與醇羥基相連的C-OH 伸縮吸收峰以及892 cm-1吡喃糖的特征吸收峰，可見制膜過程殼聚糖基本的化學(xué)骨架未發(fā)生破壞。

分析加入酸棗仁黃酮后的殼聚糖復(fù)合膜紅外光譜，沒有發(fā)現(xiàn)新的吸收峰和明顯的波長位移，這表明殼聚糖和酸棗仁黃酮之間并未生成新的化學(xué)鍵。隨著酸棗仁黃酮含量的加入，位于3 200 cm-1附近的寬峰變得比較平坦，這意味著加入的酸棗仁黃酮和殼聚糖結(jié)合相互作用降低了殼聚糖復(fù)合膜體系中-OH 和-NH的伸縮振動，而且基團(tuán)的相互影響也導(dǎo)致指紋區(qū)的某些吸收峰包括C-H 的伸縮振動甚至難以在圖上察覺。

2.4 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜X射線衍射分析

不同酸棗仁黃酮添加量的殼聚糖復(fù)合膜X-射線衍射圖如圖3 所示。

圖3 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜X-射線衍射圖Fig.3 X-ray diffraction pattern of chitosan/jujube flavonoid composite film

殼聚糖作為一種易結(jié)晶的高分子聚合物，分內(nèi)部及分子之間存在較強(qiáng)的氫鍵作用，分子結(jié)構(gòu)致密，存在晶形Ⅰ和晶形Ⅱ兩種晶形，通常，從殼聚糖醋酸溶液澆鑄而成的膜呈現(xiàn)晶形Ⅰ結(jié)構(gòu)，殼聚糖膜在2θ=10°和20°附近出現(xiàn)兩個較強(qiáng)的衍射峰[21]。而添加酸棗仁黃酮的復(fù)合膜衍射峰強(qiáng)度明顯降低甚至消失，呈現(xiàn)出非晶態(tài)彌散峰的特征。說明添加的酸棗仁黃酮與殼聚糖成膜過程形成的相互作用，破壞了殼聚糖自身分子內(nèi)和分子間原有的氫鍵，致使膜的無定形區(qū)域降低[1]。而膜的機(jī)械強(qiáng)度與結(jié)晶度密切相關(guān)，這與前面膜的力學(xué)相關(guān)特性數(shù)據(jù)檢測結(jié)論相一致。這可能是酸棗仁黃酮某種程度的不溶。

2.5 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜掃描電鏡分析

掃描電鏡圖可提供膜表面和內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)的信息，圖 4 是殼聚糖復(fù)合膜的掃描電鏡圖。圖 4（a）～（c）是不同酸棗仁黃酮添加量的復(fù)合膜的表面圖，圖4（d）～（f）為對應(yīng)的膜層截面圖。

由圖4 可見，殼聚糖空白對照復(fù)合膜表面平整光滑，均勻致密，這說明膜內(nèi)部較均勻，由于未經(jīng)過濾處理，空白殼聚糖膜表面有少許不溶物。添加酸棗仁總黃酮的殼聚糖復(fù)合膜的表面相對致密、平滑，無孔狀或裂紋，顯示出現(xiàn)較好的均一性，但事實上與空白殼聚糖膜相比較，沒有其致密，這可通過膜層截面看出來，膜抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率數(shù)據(jù)也證實了這一點(diǎn)。當(dāng)添加量為5 mL 時，膜表面出現(xiàn)類似鱗片的結(jié)構(gòu)，內(nèi)部較粗糙，推測這是由于酸棗仁總黃酮與殼聚糖膜液組分相容性差所造成的兩相分離，當(dāng)添加量進(jìn)一步增加，總黃酮濃度增高，加劇了總黃酮之間的疏水作用，誘導(dǎo)形成聚集如箭頭所示。

圖4 殼聚糖/酸棗仁黃酮復(fù)合膜掃描電鏡圖（2 000×）Fig.4 Scanning electron micrograph of chitosan/jujube flavonoid composite film（2 000×）

3 結(jié)論

殼聚糖是天然的高分子線性多糖，無毒、抗菌，具有良好的生物相容性和可降解性。本文采用流延法制備殼聚糖復(fù)合膜，在殼聚糖膜液中添加具有抑菌作用和抗氧化作用的酸棗仁黃酮提取液。隨著復(fù)合膜中酸棗仁黃酮提取液的逐漸增加，致使殼聚糖分子之間作用力減弱，復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度、斷裂伸長率呈現(xiàn)明顯的降低趨勢，而膜的厚度和密度則呈現(xiàn)變大的規(guī)律，膜透明度逐漸減小有利于作為包裝材料避光防止抗氧化。殼聚糖復(fù)合膜紅外光譜顯示殼聚糖分子的基本骨架并未因為膜的制備發(fā)生改變，殼聚糖和酸棗仁黃酮之間未生成新的化學(xué)鍵，但彼此相互作用影響導(dǎo)致某些基團(tuán)吸收峰強(qiáng)度減弱甚至難以察覺，X-射線衍射分析表明殼聚糖復(fù)合膜呈現(xiàn)非晶態(tài)彌散峰的特征，SEM 分析證實雖然復(fù)合膜表面光滑致密，但有酸棗仁總黃酮的聚集現(xiàn)象。