綠球藻多糖分離純化及抗氧化活性研究

李旭東，孫彥峰，馮佳，呂俊平，劉琪，南芳茹，劉旭東，謝樹蓮

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

天然多糖具有良好的生物活性和功能，包括抗腫瘤、抗病毒、免疫作用和抗氧化作用等[1-3]，在醫(yī)療和保健方面所具有的重要潛在應(yīng)用價值日益顯現(xiàn)，具有廣泛的前景。近年來，人們發(fā)現(xiàn)一些微藻中富含多糖，具有增強機體免疫、抗病毒、抗惡性腫瘤、抗炎癥、抗類風濕性關(guān)節(jié)炎、降血壓、降血脂、降血糖、健胃、防早衰、抗輻射等防病治病的輔助作用，如紫球藻、念珠藻、螺旋藻等[4-6]。加上微藻具有生長速度快、適應(yīng)性強、在人工培養(yǎng)下能夠大量繁殖、占地面積小、生產(chǎn)成本低等特性，因此，藻多糖具有較高的商品價值和廣闊的市場前景[7]。

綠球藻（Chlorococcum sp.GD）屬單細胞綠藻，富含多糖、蛋白質(zhì)、黃酮類、酚類、β-胡蘿卜素等，其藻多糖能有效清除自由基，具有良好的抗氧化性，可用作飼料和食品生產(chǎn)實踐[8]。

多種提取方法被報道用于藻類多糖提取。熱水浸提法由于提取過程簡單、成本較低，是主要的提取方法。該方法可將大部分水溶性多糖提取，但得到的多糖提取液中還含有大量藻體、細胞碎片、蛋白質(zhì)和其它膠狀物質(zhì)等，這些雜質(zhì)使提取液黏度增大，影響后續(xù)的分離純化工序，因此需要進一步分離提純[9-10]。

本文采用熱水浸提法對綠球藻（Chlorococcum sp.GD）中的多糖進行提取，并利用纖維素層析和凝膠層析進行分級純化，進而通過試驗考查綠球藻粗多糖及純化后多糖的抗氧化性，以期為進一步研究綠球藻多糖活性提供試驗基礎(chǔ)，同時也為綠球藻多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠球藻（Chlorococcum sp.GD）：采自山西省關(guān)帝山。藻種由山西大學(xué)藻類學(xué)實驗室分離、保藏并培養(yǎng)。

葡萄糖、維生素 C（VC）、硫酸、氯仿、氫氧化鈉、正丁醇、三氟乙酸、氯仿、磷酸鈉、鄰苯三酚、氯化鈉和無水乙醇：上海生工生物工程有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、2，2′-連氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、過硫酸鉀和菲洛嗪：Sigma 公司；以上試劑均為分析純。

葡聚糖凝膠（Sephadex G-150）：上海江萊生物科技有限公司；二乙胺基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纖維素：美國Whatman 公司；所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS50）：賽默飛世爾科技有限公司；紫外可見分光光度（TU-1810DAPC）：北京普析通用儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HH-2）：常州國華電器有限公司；高速冷凍離心（HC-2518R）：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；冷凍干燥器（SCIENTZ-18ND）：寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司；全功能酶標儀（Synergy H1）：美國BioTek Instruments，Inc.；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RF-02）：上海普渡生化科技有限公司。

1.3 綠球藻多糖的制備及純化

1.3.1 綠球藻粗多糖（crude Chlorococcum polysaccharide，CCP）的制備

將一定量的綠球藻粉末與蒸餾水按質(zhì)量比1 ∶25混合，在95 ℃熱水提取2 h，經(jīng)真空抽濾后收集濾液，殘渣再次熱水提取1 h，合并兩次濾液并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀80 ℃下濃縮至原體積的1/3，按3 ∶1 體積比加入氯仿-正丁醇溶液（4/1，體積比），沉淀蛋白2 次[11]。然后將水相與氯仿相分開，得到粗多糖溶液。提取液經(jīng)再次濃縮至原體積1/3 后，按體積比1 ∶3 加入85%乙醇溶液沉淀多糖，4 ℃過夜。離心后將沉淀冷凍干燥，得綠球藻粗多糖CCP。

1.3.2 綠球藻粗多糖的純化

稱取綠球藻粗多糖0.2 g，用最少量的蒸餾水溶解。上 DEAE-52 纖維素層析柱（50 cm×2.6 cm），先用蒸餾水洗至無糖檢出，依次用0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 洗脫，洗脫速度為1 mL/min，分管收集，每管5 mL，收集液用硫酸-苯酚法測定A490nm值，以管號為橫坐標，A490nm

值為縱坐標繪制洗脫曲線[12]，并收集各洗脫峰部分，濃縮、透析、冷凍干燥。

取上述洗脫峰部分最多的多糖2 mg，溶于1 mL蒸餾水，上 Sephadex G-150 層析柱（100 cm×1.5 cm），用蒸餾水以0.2 mL/min 速度洗脫，按每管5 mL 接洗脫液，隔管用苯酚-硫酸法在波長490 nm 處檢測吸光度，繪制洗脫曲線。

1.3.3 粗多糖含量的測定

準確稱取標準葡萄糖20 mg 于500 mL 容量瓶中，加水至刻度，分別吸取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以蒸餾水補至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL 及濃硫酸5.0mL，搖勻冷卻，沸水浴顯色15min以后于490 nm 測吸光度，以2.0 mL 水按同樣顯色操作為空白，橫坐標為糖含量，縱坐標為吸光值，繪制標準曲線[13]。

綠球藻粗多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品，建立了標準曲線。采用干重法，測定綠球藻粗多糖提取液中多糖含量。

多糖提取率/%=（測定液中多糖濃度×測定液總體積）/綠球藻多糖總質(zhì)量×100

1.3.4 純化多糖的紫外可見光譜掃描

收集純化綠球藻多糖溶液，制成約1 mg/mL 溶液，用紫外-可見用紫外-可見分光光度計在紫外-可見區(qū)200 nm～500 nm 內(nèi)進行掃描，得紫外-可見吸收光譜，觀察其光譜特征及在波長260 nm 和280 nm 處紫外吸收特征，檢測是否有核酸和蛋白質(zhì)存在。

1.3.5 純化多糖的傅立葉變換紅外光譜掃描（fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR）

純化多糖的紅外光譜采用傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS50）以衰減全反射模式進行掃描，掃描波數(shù)范圍為 3 500 cm-1～650 cm-1，分辨率為 0.1 cm-1。

1.4 綠球藻多糖的抗氧化活性

1.4.1 對DPPH 自由基的清除作用

參照馮學(xué)珍等[14]的方法，略作修改。分別取500 μL不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的綠球藻多糖水溶液，加入500 μL 濃度為0.04 mg/mL 的DPPH溶液，混勻后室溫25 ℃避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測定吸光度（A）值。對照組用500 μL 無水乙醇溶液代替DPPH 溶液，空白組用500 μL 去離子水代替多糖溶液，不同濃度的VC替代多糖樣品作為陽性對照。每個樣品重復(fù)3 次。

式中：A0為樣品的吸光值；Aa為對照 （用500 μL無水乙醇溶液代替DPPH 溶液）吸光值；Ab為空白（用500 μL 去離子水代替多糖溶液）吸光值。

1.4.2 對羥基自由基的清除作用

參照程超等[15]的方法，略作修改。取1 mL 不同質(zhì)量濃度的綠球藻多糖溶液 （0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）于試管中，向各管中加入2 mL 硫酸亞鐵（FeSO4）溶液（3 mmol/L）和 1.5 mL 水楊酸溶液（1.8 mmol/L）?；靹蚝螅尤?.03%雙氧水0.1 mL 啟動反應(yīng)，混勻。37 ℃水浴30 min，在波長510 nm 下測定A 值。以去離子水代替多糖溶液做空白，不同濃度的VC替代多糖樣品作為陽性對照。每個樣品重復(fù)3 次。

式中：A0為空白（用去離子水代替多糖溶液）吸光值；Aa為樣品的吸光值。

1.4.3 對超氧陰離子自由基的清除作用

參照陳玫等[16]和韓少華等[17]的方法，略作修改。向各管中加入900 μL 磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 8.2），25 ℃水浴 20 min，向各試管中加入 200 μL 不同質(zhì)量濃度的多糖溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。其中空白以去離子水代替多糖溶液，然后加入25 mmol/L的鄰苯三酚溶液80 μL，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入 80 mmol/L HCl 200 μL 終止反應(yīng)，并搖勻，反應(yīng)3 min，5 000 r/min 離心。酶標儀波長420 nm 處測定吸光值。以去離子水代替多糖溶液作為空白，對照用磷酸鹽緩沖液代替樣品液。不同濃度的VC替代多糖樣品作為陽性對照。每個樣品重復(fù)3 次。

式中：A0為樣品的吸光值；Aa為對照（磷酸鹽緩沖液代替樣品液）吸光值；Ab為空白（用去離子水代替多糖溶液）吸光值。

1.4.4 ABTS+自由基清除能力測定

參照有關(guān)文獻的方法[18]，將ABTS 溶液（7 mmol/L，5 mL）和過硫酸鉀溶液（140 mmol/L，88 μL）混合，室溫25 ℃避光反應(yīng)12 h～16 h，制備ABTS+自由基儲備液。使用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH7.4）將儲備液稀釋至其在734 nm 處吸光值為0.70±0.02，備用。取不同濃度多糖溶液各1 mL，加3 mL ABTS+自由基溶液，于暗處反應(yīng)1 h，記錄其在734 nm 處的吸光度。以1 mL 純水代替樣品作為空白，相同操作。每個樣品重復(fù)3 次。

式中：Ax為樣品的吸光值；A0為空白的吸光值。

1.4.5 還原能力的測定

參照有關(guān)文獻的方法[19]，準確量取1.0 mL 不同質(zhì)量濃度的多糖樣品（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。樣品液移至10 mL 具塞試管中，加入1.0 mL 磷酸鈉緩沖溶液（1.0 moL/L，pH 6.6）和 2.5 mL K3[Fe（CN）6]（1 %），50 ℃恒溫水浴20 min，取出冷卻后加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻，5 000 r/min 離心 5 min，取 2.5mL 上清液，加2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 1%FeCl3溶液，混勻。以蒸餾水為空白，于波長700 nm 處測定其吸光值，以VC作為對照[20]。每個樣品重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠球藻多糖的特性

2.1.1 綠球藻粗多糖含量測定結(jié)果

繪制的標準曲線見圖1，得到回歸方程為Y =0.008 2X+0.090 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 6。代入公式，計算出綠球藻粗多糖提取率為6.07%。

2.1.2 綠球藻粗多糖純化分析

綠球藻粗多糖DEAE-52 纖維素柱層析洗脫曲線見圖2。

圖1 葡萄糖含量標準曲線Fig.1 Standard curve of of glucose content

圖2 綠球藻粗多糖DEAE-52 纖維素柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curves of crude Chlorococcum sp.GD polysaccharides by DEAE-52cellulose column chromatography

由圖2 可知，綠球藻粗多糖CCP 經(jīng)DEAE-52 纖維素柱層析分離后獲得3 個組分，分別命名為CPP-Ⅰ、CPP-Ⅱ和CPP-Ⅲ。將含量最高的組分CPP-Ⅰ進一步采用Sephadex G-150 凝膠層析柱純化，得到組分CPP-Ⅳ，洗脫峰為單一峰（見圖3），且峰形對稱，表明CPP-Ⅳ為單一組分。

圖3 綠球藻多糖CPP-ⅠSephadex G-150 柱層析洗脫曲線Fig.3 Elution curves of Chlorococcum sp.GD polysaccharides CPP-Ⅰby Sephadex G-150 column chromatography

2.1.3 綠球藻純化多糖紫外光譜分析

綠球藻純化多糖的紫外光譜見圖4。

圖4 綠球藻純化多糖的紫外光譜Fig.4 Ultraviolet spectrum of polysaccharides from Chlorococcum sp.GD

由圖4 可知，綠球藻純化多糖在紫外區(qū)波長247 nm 處有最大吸收峰。由于核酸和蛋白質(zhì)吸收峰為260 nm 和280 nm，而圖中 260 nm 和 280 nm 處無吸收峰，表明綠球藻純化多糖中核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)已清除，具有較高的純度。

2.1.4 綠球藻純化多糖紅外光譜分析

綠球藻純化多糖的紅外光譜見圖5。

圖5 綠球藻純化多糖的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of Chlorococcum sp.GD polysaccharides

從光譜特征看，CPP-Ⅳ在 3 180、2 984、1 629 cm-1及1 036 cm-1具有較強吸收，為典型的多糖特征吸收[21]。在波數(shù) 3 400 cm-1～3 180 cm-1的吸收峰主要為糖類的O-H 及 N-H 的伸縮振動，2 984 cm-1處的吸收峰為-CH3-鍵伸縮振動，2 943 cm-1處的吸收峰為-CH2-鍵伸縮振動，1 629 cm-1附近的吸收峰可能是酰胺基中C=O 伸縮振動，1 551 cm-1吸收峰為-NO2-伸縮振動，1 400 cm-1～1 200 cm-1內(nèi)的吸收主要為C-H 變角振動引，1 295 cm-1可能是硫酸基吸收峰[22]，1 036 cm-1的強吸收是C-O-C 或C-O-H 中的C-O 鍵的彎曲振動，為葡萄糖的特征吸收[23-24]，909 cm-1處為C-H 變形振動，662 cm-1處為O-H 面外彎曲。由紅外圖譜可知CPP-Ⅳ具有明顯的糖類化合物的特征。

2.2 綠球藻多糖的抗氧化活性分析

2.2.1 綠球藻多糖對DPPH 自由基的清除能力

圖6 為綠球藻多糖對DPPH 自由基的清除能力。

圖6 綠球藻多糖的DPPH 自由基清除率Fig.6 DPPH radical removal rate of Chlorococcum sp.GD polysaccharide

由圖6 可以看出，隨著濃度的增加，綠球藻純化多糖對DPPH 自由基的清除率逐漸增強。相比粗多糖，純化多糖CPP-Ⅳ對DPPH 自由基的清除率明顯更高。當粗多糖和CPP-Ⅳ的濃度達到0.6 mg/mL 時，DPPH自由基清除率基本穩(wěn)定，超過90%。當CPP-Ⅳ的濃度達到1 mg/mL 時，DPPH 自由基清除率達到96.13%，與陽性對照VC基本相同。此前，有報道其他藻類多糖也具有較好的自由基清除能力，如紫球藻（Porphyridium cruentum）多糖在濃度為0.5 mg/mL 時清除率趨于穩(wěn)定，達到84 %，婁翠等[25]海帶（Laminaria japonica）巖藻多糖PFS-2 在濃度為1 mg/mL 時，清除率接近55%。相比之下，綠球藻多糖CPP-Ⅳ具有更好的DPPH 自由基清除能力。

2.2.2 綠球藻多糖對羥基自由基的清除能力

圖7 為綠球藻多糖的羥基自由基清除率。

圖7 綠球藻多糖的羥基自由基清除率Fig.7 Hydroxyl radical removal rate of Chlorococcum sp.GD polysaccharide

由圖7 可知，隨著濃度的增加，綠球藻多糖對羥基自由基的清除率逐漸增強。純化多糖CPP-Ⅳ對羥基自由基的清除率略高于粗多糖。當CPP-Ⅳ的濃度達到0.6 mg/mL 時，羥基自由基清除率基本穩(wěn)定，超過70%。當CPP-Ⅳ的濃度為1 mg/mL 時，羥基自由基的清除率為70.6%，雖然效果不及VC（88.22%），但與有的藻類相比，效果明顯更好。如地皮菜（Nostoc commune）多糖CCB 和CB-2-1 組分在1 mg/mL 時，羥基自由基清除率分別為35.2%和49.5%[26]。

2.2.3 綠球藻多糖對超氧陰離子的清除能力

圖8 為綠球藻多糖的超氧陰離子清除率。

圖8 綠球藻多糖的超氧陰離子清除率Fig.8 Superoxide anion radical removal rate of Chlorococcum sp.GD polysaccharide

從圖8 可以看出，隨著濃度的增加，綠球藻多糖對超氧陰離子的清除率逐漸增強。粗多糖與純化多糖CPP-Ⅳ對超氧陰離子的清除率基本相同。當CPP-Ⅳ和粗多糖的濃度達到1 mg/mL 時，超氧陰離子清除率分別達到52.46%和43.72%。雖然明顯不及VC（96.13%）的清除能力，但仍然表明綠球藻多糖具有一定的抗氧化作用。

2.2.4 ABTS+自由基清除能力

綠球藻多糖的ABTS+自由基清除率見圖9。

圖9 綠球藻多糖的ABTS自由基清除率Fig.9 ABTS free radical removal rate of Chlorococcum sp.GD polysaccharide

從圖9 可以看出，隨著濃度的增加，綠球藻多糖對ABTS+自由基的清除率逐漸增強。純化多糖CPP-Ⅳ效果略優(yōu)于粗多糖。當CPP-Ⅳ的濃度達到1 mg/mL 時，ABTS+自由基清除率可達27.07%。雖然明顯不及VC（約90%）的清除能力，但仍然表明綠球藻多糖具有一定的抗氧化作用。也有文獻報道，泡葉藻（Ascophyllum nodosum）和銅藻（Sargassum horneri）多糖相同濃度下，ABTS清除率分別可達約40%和90%[27-28]。

2.2.5 還原力測定

綠球藻多糖的還原力見圖10。

圖10綠球藻多糖的還原力Fig.10 Reducing power of Chlorococcum sp.GD polysaccharid

從圖10可以看出，隨著濃度的增加，綠球藻多糖的還原力逐漸增強。純化多糖CPP-Ⅳ效果優(yōu)于粗多糖。當CPP-Ⅳ的濃度達到1 mg/mL時，OD700nm為0.404，雖然明顯不及VC（1.223）的還原力（吸光度越大表示還原能力越強），但仍然表明綠球藻多糖具有一定的抗氧化作用。據(jù)有關(guān)文獻[28-32]，在相同多糖濃度下，銅藻多糖（tongzao polysaccharide，TZP）組分OD700nm為0.8，月見草葉中提取的多糖OD700nm為0.6，枸杞多糖組分LBP2的OD700nm為0.521，米酒多糖OD700nm為0.494，紫薯多糖OD700nm為0.49。相比其他植物源多糖，綠球藻多糖也具有一定的還原力。

3 結(jié)論

采用傳統(tǒng)熱水浸提方法對綠球藻粗多糖進行分離純化，多糖提取率為6.07%。通過DEAE-52纖維素柱層析和Scphadex G-150葡聚糖凝膠柱將綠球藻粗多糖組分進行分級純化，得到4個組分CPP-Ⅰ、CPP-Ⅱ、CPP-Ⅲ和CPP-Ⅳ，且純度較高。綠球藻多糖對DPPH自由基和羥基自由基具有明顯的清除效果，清除率分別超過90%和70%，且純化多糖CPP-Ⅳ的效果優(yōu)于粗多糖CCP。綠球藻多糖對超氧陰離子和羥基自由基也具有一定的清除效果，雖然不及VC，但仍然表明純化多糖具有很好的抗氧化活性，并且清除率隨多糖的濃度增大而增加。