紅景天當歸不同配伍對免疫低下小鼠免疫功能的影響

史頂聰，趙宏宇，佟曉樂，張鳳清，*

（1.長春工業(yè)大學化學與生命科學學院，吉林長春130012；2.吉林省中醫(yī)藥科學院，吉林長春130021；3.吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，吉林集安134200）

以免疫力低下和慢性疲勞為主要癥狀的亞健康問題是21 世紀威脅人類健康的重大問題，亞健康狀態(tài)以疲勞、活力減退、免疫力降低為主要的臨床表現(xiàn)，發(fā)生率呈逐年增加的趨勢。因此，以提高免疫力和抗疲勞來預防亞健康為切入點具有非常重要的作用。筆者通過以往藥理研究發(fā)現(xiàn)，紅景天[1-3]和當歸[4-6]具有很好的活性，已有眾多學者研究報道了其藥理活性，如抗病毒、抗腫瘤、刺激免疫球蛋白和抗體的產(chǎn)生，增強機體免疫和抗氧化能力等，且抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等活性已被應用于臨床研究。紅景天首載的藏醫(yī)藥著作是《四部典醫(yī)》，性甘、苦、平，歸肺、心經(jīng)；益氣活血，通脈平喘；用于氣虛血瘀，胸痹心痛，中風偏癱，倦怠氣喘[7]。當歸始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》謂之“當歸味溫，主呃逆上氣”被列為中品[8]。從國家食品藥品監(jiān)督管理總局查詢已注冊的國內(nèi)外具有增強免疫的保健食品，紅景天114 種，當歸170 種，紅景天當歸共同使用的有6 種。在筆者查閱相關(guān)文獻報道中，紅景天和當歸在各種保健食品中配伍比例不盡相同，效果也各有差異。筆者通過研究紅景天和當歸不同配伍比例對免疫低下小鼠的作用，給紅景天和當歸配伍產(chǎn)品的研究開發(fā)提供一定科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

雄性 KM 小鼠 210 只，SPF 級，體重為 18 g～22 g：長春生物制品研究所有限責任公司，合格證號SCXK-（吉）2011-0003，由吉林省中醫(yī)藥科學院實驗動物倫理委員會審核通過，符合實驗動物倫理委員會規(guī)定。

1.2 儀器

JA2003B 千分之一天平：上海越平科學儀器有限公司產(chǎn)品；BT418/3 電子天平：深圳市博途電子科技有限公司；723 可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；DT5-3 型低速臺式自動平衡離心機：北京時代北利離心機有限公司；KDC-2046 低速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；SSW-600-2S 型電熱恒溫水槽、BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 藥品與試劑

紅景天由長春工業(yè)大學食品實驗室提供，經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學院牛志多副主任鑒定為紅景天為本品為景天科植物大花紅景天Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H.Ohba 的干燥根和根莖。當歸由長春工業(yè)大學食品實驗室提供，經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學院牛志多副主任鑒定為當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根。印度墨水：上海源葉生物科技有限公司；無水碳酸氫鈉：分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司，使用時現(xiàn)用現(xiàn)配；巴比妥酸.二水、巴比妥鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉、葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸、丙酮：分析純，北京化工廠；2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）：分析純，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；麻油：市售。

1.4 樣品制備

1.4.1 紅景天

將紅景天加 70 %乙醇，料液比 1 ∶10（g/mL），回流提取3 次，每次1 h，過濾，濾液合并，濾液減壓回收乙醇（60 ℃，-0.06 MPa）得濃縮液，真空干燥（60 ℃，-0.08 MPa），冷卻得干膏，粉碎，出膏率為28.6%，有效成分為紅景天苷，干膏紅景天苷含量為361 mg/100 g。

1.4.2 當歸

當歸：將當歸加水，料液比為 1 ∶10（g/mL），浸泡30 min，水煎煮 3 次，分別為 2、1、1 h，過濾，將提取液減壓旋蒸后減壓干燥得干膏，粉碎得干膏粉，出膏率為36.8 %，有效成分為粗多糖，干膏粗多糖含量為2.6 g/100 g。

2 方法

2.1 分組與給藥

雄性 KM 小鼠 210 只，適應 3 d，隨機分為3 個部分（細胞免疫實驗、體液免疫實驗、非特異性免疫實驗），每部分70 只。將每部分的70 只雄性KM 小鼠隨機分為 7 組，每組 10 只，即對照組（C 組）、模型組（M組）、紅景天組（R 組）、當歸組（A 組）、紅景天當歸質(zhì)量比 2 ∶1 配伍組（RA1 組）、紅景天當歸 1 ∶1 配伍組（RA2 組）、紅景天當歸 1 ∶2 配伍組（RA3 組）。其中，C組和M 組小鼠給予蒸餾水，R 組給予286 mg/（kg·d）紅景天提取物，A 組給予368 mg/（kg·d）當歸提取物，RA1組、RA2 組、RA3 組分別給予313、327、341 mg/（kg·d）紅景天提取物和當歸提取物不同配比的樣品，各受試物組灌胃劑量均相當于生藥材1 000 mg/（kg·d）。各組小鼠均在每天上午 9：00～10：00 按照 10 mL/kg 給予相應受試物，每天1 次，連續(xù)30 d，每周稱1 次體重，根據(jù)體重調(diào)整灌胃量。于第 26 天開始，M 組、R 組、A 組、RA1 組、RA2 組、RA3 組小鼠分別按100 mg/（kg·d）腹腔注射環(huán)磷酰胺，造成免疫低下模型，連續(xù)4 d。

2.2 細胞免疫功能—遲發(fā)型變態(tài)反應

DNFB 溶液配制：稱取DNFB 50 mg，置清潔干燥小瓶中，將預先配好的5 mL 丙酮麻油體積比為1 ∶1溶液，倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠布密封，混勻后，備用。

第25 天灌胃后，所有小鼠腹部剪毛，范圍約3 cm×3 cm，除C 組外其余組小鼠用新配置的DNFB 溶液50 μL 均勻涂抹腹部致敏，進行初次免疫，C 組以同體積丙酮、麻油的混合液均勻涂抹腹部。5 d 后，除C 組外其余組小鼠用DNFB 溶液10 μL 均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊，C 組以等量丙酮、麻油 1 ∶1 的混合液涂抹右耳。攻擊24 h 后，頸椎脫臼處死小鼠，用打孔器取下直徑8 mm 的耳片，稱重。用耳腫脹度表示遲發(fā)變態(tài)反應的程度。同時取胸腺和脾臟，計算臟器指數(shù)。

耳腫脹度（mg）＝右耳質(zhì)量（mg）－左耳質(zhì)量（mg）

2.3 體液免疫功能--血清溶血素測定

水楊酸緩沖液（salicylic acid buffer，SA 緩沖液）：巴比妥酸0.46 g，氯化鎂0.1 g，氯化鈣0.2 g，氯化鈉8.38 g，碳酸氫鈉0.252 g，巴比妥鈉0.3 g，加蒸餾水至1 000 mL，25 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

阿氏液（羊紅細胞保護液）：葡萄糖2.05 g，檸檬酸鈉0.8 g，檸檬酸0.055 g，氯化鈉0.42 g，加蒸餾水至100 mL 溶解，pH 值調(diào)到6.1，經(jīng)過114 ℃高壓蒸汽滅菌10 min，待冷卻后，放置在4 ℃冰箱內(nèi)，保存?zhèn)溆谩?/p>

綿羊紅細胞制備：綿羊站立，向上固定綿羊脖子，清除脖子部位羊毛后，頸靜脈取血。將羊血放入裝有滅菌玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個方向搖動，以脫纖維，制備綿羊紅細胞。按羊紅細胞∶阿氏液=1 ∶2 的體積比例，將阿氏液加入到綿羊紅細胞中。放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。一周更換兩次保護液。

給予受試物27 d 后，取部分綿羊紅細胞，移入滅菌的刻度離心管內(nèi)，加入生理鹽水，混勻后，2 000 r/min離心10 min，去除上清液，再加生理鹽水混勻離心，反復洗至上清成清澈透明狀，最后將上清棄掉，留下壓積的綿羊紅細胞（sheep red blood cell，SRBC），用生理鹽水配成2%（體積分數(shù)）的細胞懸液，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 的細胞懸液進行免疫。

補體制備：5 只豚鼠，禁食不禁水5 h 后，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈采集豚鼠血，25 ℃放置1 h，2 000 r/min 離心10 min，取上清。另取部分綿羊紅細胞，以生理鹽水反復洗至上清成清澈透明狀，將上清棄掉，留下壓積的紅細胞（SRBC），按 SRBC ∶豚鼠血清=1 ∶5（體積比）的比例，將SRBC 加入到豚鼠血清中，放入 4 ℃冰箱 30 min，2 000 r/min 離心 10 min，取上清，－70 ℃保存。用時以 SA 緩沖液按 1 ∶8 體積比稀釋。

給予受試物30 d 后，小鼠稱重，摘除眼球，取血于離心管內(nèi)，放置約1 h 后，低速冷凍離心機2 000 r/min離心10 min，吸取血清備用。取小鼠血清，用SA 緩沖液稀釋200 倍。吸取1 mL 的稀釋后血清置試管內(nèi)，依次加入0.5 mL10%（體積比）SRBC，1 mL 補體（用 SA緩沖液按1 ∶8 稀釋）。另設(shè)不加血清的對照管（以SA 緩沖液代替）。置37 ℃恒溫水浴中保溫15 min 后，冰浴終止反應。2 000 r/min 離心10 min，取上清液1 mL，加都氏試劑3 mL，同時取10%（體積分數(shù)）SRBC 0.25 mL 加都氏試劑至4 mL，充分混勻，放置10 min 后，于540 nm處以對照管調(diào)零，分別測定各管吸光度。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下列公式計算：

樣品HC50＝（樣品管吸光度值/SRBC 半數(shù)溶血時管的吸光度值）×稀釋倍數(shù)

2.4 非特異性免疫—碳廓清實驗

各組小鼠于末次給藥1 h 后，將各組小鼠稱量體重，各組小鼠按0.01 mL/g 平行由尾靜脈注入按1 ∶3體積比加蒸餾水稀釋的印度墨汁。待墨汁注入小鼠靜脈后，立即記錄注入時間。小鼠注入墨汁后2、10 min，分別從小鼠內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，立即將其加到盛有2 mL 0.1%碳酸鈉溶液試管中。用723 分光光度計在600 nm 波長處測光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白對照。

將小鼠處死，摘取小鼠肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，用千分之一天平稱重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數(shù)a。

K=（lgOD1-lgOD2）/（t2－t1）；吞噬指數(shù)a＝體重/（肝重＋脾重）×K1/3

式中：K 為吞噬速率（未經(jīng)矯正的吞噬指數(shù)）；OD1為t1血標本的OD 值；OD2為t2血標本的OD 值；t1為注入墨汁后第一次取血時間（2 min）；t2為注入墨汁后第二次取血時間（10 min）。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果與分析

3.1 測定結(jié)果

與模型組相比較，紅景天和當歸不同比例對小鼠的胸腺、脾臟均有影響，紅景天和當歸單獨作用效果不明顯，結(jié)果見表1。

表1 紅景天當歸不同配伍對小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響（n=10，）Table 1 Effects of different compatibility of rhodiola and angelica on spleen and thymus index of mice（n=10，）

表1 紅景天當歸不同配伍對小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響（n=10，）Table 1 Effects of different compatibility of rhodiola and angelica on spleen and thymus index of mice（n=10，）

注：-表示等條件下按10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃；*表示P＜0.05，與M組比較具有差異性；**表示P＜0.01，與M 組比較具有顯著差異性。

胸腺指數(shù)/（g/10 g）C 組 10 - 4.52±0.77**3.29±0.61**M 組 10 - 3.67±0.55 2.48±0.91 R 組 10 286 4.03±0.69 2.87±0.81 A 組 10 368 3.99±0.60 2.74±0.49 RA1 組 10 313 4.21±0.61*2.97±0.53*RA2 組 10 327 4.27±0.53*2.99±0.51*RA3 組 10 341 4.13±0.55*2.94±0.44*組別 小鼠只數(shù) 灌胃量/（mg/kg）脾臟指數(shù)/（g/10 g）

與C 組比較，M 組的脾臟、胸腺指數(shù)均顯著降低，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與 M 組比較，R 組和 A 組各指數(shù)均有所升高但無顯著性，不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），RA1 組、RA2 組和 RA3 組脾臟、胸腺指數(shù)均明顯升高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），RA2 組各項指數(shù)略高于RA1 組和RA3 組。

3.2 細胞免疫實驗測定結(jié)果

細胞免疫實驗中，與模型組相比較，紅景天和當歸不同比例中RA2 組效果明顯，其余各組作用效果不明顯，結(jié)果見表2。

與C 組比較，M 組左右耳腫脹差值顯著低于C組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與 M 組比較，R 組、A組、RA1 組、RA3 組左右耳腫脹差均高于 M 組，但不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），RA2 組左右耳腫脹差明顯高于 M 組，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 細胞免疫實驗測定結(jié)果（n=10，）Table 2 Cellular immunoassay results（n=10，）

表2 細胞免疫實驗測定結(jié)果（n=10，）Table 2 Cellular immunoassay results（n=10，）

注：-表示等條件下按10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃；*表示P＜0.05，與M 組比較具有差異性；**表示P＜0.01，與M 組比較具有顯著差異性。

組別小鼠只數(shù)灌胃量/（mg/kg） 左右耳腫脹差/mg C 組 10 - 5.28±0.89**M 組 10 - 3.88±1.21 R 組 10 286 4.31±1.08 A 組 10 368 4.25±0.97 RA1 組 10 313 4.56±1.11 RA2 組 10 327 4.85±0.91*RA3 組 10 341 4.43±1.06

3.3 體液免疫實驗測定結(jié)果

體液免疫實驗中，與模型組相比較，紅景天和當歸不同比例對小鼠的半數(shù)溶血值（200 倍稀釋）效果均較為明顯，紅景天個當歸作用效果不明顯，結(jié)果見表3。

表3 體液免疫實驗測定結(jié)果（n=10，）Table 3 Results of humoral immunity test（n=10，）

表3 體液免疫實驗測定結(jié)果（n=10，）Table 3 Results of humoral immunity test（n=10，）

注：-表示等條件下按10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃；*表示P＜0.05，與M組比較具有差異性；**表示P＜0.01，與M 組比較具有顯著差異性。

組別小鼠只數(shù)灌胃量/（mg/kg）半數(shù)溶血值（200 倍稀釋）/%C 組 10 - 105.37±20.11**M 組 10 - 72.55±21.50 R 組 10 286 83.88±22.31 A 組 10 368 80.24±20.65 RA1 組 10 313 94.87±22.66*RA2 組 10 327 95.50±20.81*RA3 組 10 341 91.33±19.88*

與 C 組比較，M 組 HC50顯著降低，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與 M 組比較，R 組和 A 組 HC50有所升高，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），RA1 組、RA2 組、RA3 組明顯升高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），RA2 組略高于RA1組和RA2 組。

3.4 非特異性免疫實驗測定結(jié)果

非特異性免疫實驗中，與模型組相比較，各組對小鼠的吞噬數(shù)率和吞噬指數(shù)均有明顯的影響，結(jié)果見表4。

與C 組比較，M 組K 值顯著降低，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），吞噬指數(shù)（α）明顯降低，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與 M 組比較，R 組、A 組、RA1 組、RA3 組吞噬速率（K）值明顯升高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），RA2 組 K 值顯著升高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），R組、A 組、RA1 組、RA2 組、RA3 組吞噬指數(shù) α 明顯升高，均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表4 非特異性免疫實驗測定結(jié)果（n=10，）Table 4 Non-specific immunoassay results（n=10，）

表4 非特異性免疫實驗測定結(jié)果（n=10，）Table 4 Non-specific immunoassay results（n=10，）

注：-表示等條件下按10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃；*表示P<0.05，與M組比較具有差異性；**表示P<0.01，與M 組比較具有顯著差異性。

組別 小鼠只數(shù) 灌胃量/（mg/kg）吞噬速率K（×100） 吞噬指數(shù)α 5.15±0.66*M 組 10 - 2.88±0.80 4.20±0.74 R 組 10 286 3.66±0.77*4.94±0.77*A 組 10 368 3.71±0.81*5.05±0.62*RA1 組 10 313 3.79±0.88*5.04±0.69*RA2 組 10 327 3.99±0.96**5.11±0.71*RA3 組 10 341 3.80±0.91*5.10±0.77*C 組 10 - 4.13±1.05**

4 討論與結(jié)論

醫(yī)學研究表明，免疫系統(tǒng)是由免疫器官、免疫細胞和免疫分子等組成。免疫系統(tǒng)具有抗感染的免疫防御功能，具有能夠及時識別、清除體內(nèi)損傷或衰老細胞的免疫自穩(wěn)功能。具有能夠及時識別細胞復制錯誤或細胞突變并將其清除的免疫監(jiān)視功能[9]。研究表明，正常的免疫功能對機體有利，對異體抗原如病原微生物、細菌毒素等產(chǎn)生排斥反應，發(fā)揮免疫保護作用；但當免疫功能異常時可造成機體自身組織損傷，導致超敏反應、免疫缺陷及自身免疫病等[10]。本研究就細胞免疫，體液免疫和非特異性免疫三方面指標進行了動物體內(nèi)實驗，綜合評價紅景天提取物和當歸提取物不同配伍對免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

紅景天能刺激B 細胞和巨噬細胞活化淋巴細胞產(chǎn)生白細胞介素-12[11-12]（interleukin-12，IL-12），IL-12可刺激活化型 T 細胞增殖，促進 Th1 細胞分化[11，13-14]；IL-12 誘導細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和NK 細胞的細胞活性并促進其分泌γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）[15]，促進抗原呈遞、提高 NK細胞活性和巨噬細胞溶酶體活性。紅景天能明顯增加免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）的含量[16-17]，促發(fā)抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用[17-18]（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC） 效應，IgG抗體通過Fab 段與靶細胞表面抗原決定簇特異性結(jié)合后，其 Fc 段[19]可與有 FcγR 的殺傷細胞 NK 細胞結(jié)合，觸發(fā)效應細胞的殺傷活性，直接殺傷靶細胞。紅景天苷灌胃小鼠后能明顯促進小鼠脾細胞的增殖反應，增強脾細胞對白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）的反應性，增加小鼠脾細胞對T 細胞分泌的淋巴因子IL-2 的分泌[11，20]，從而表現(xiàn)出紅景天苷具有明顯調(diào)解和增強機體免疫力的功能。

當歸在促進單核巨噬細胞活化后，作用于各種免疫效應細胞，產(chǎn)生相應的細胞因子并參與機體的神經(jīng)、體液及內(nèi)分泌系統(tǒng)來實現(xiàn)增強免疫。臨床研究表明，當歸多糖可以激活不同種類的免疫細胞，同時也可以激活補體系統(tǒng)，促進細胞因子的生成，對免疫系統(tǒng)起恢復調(diào)節(jié)的作用[21]。當歸多糖直接作用于外周血中的免疫細胞后，髓系單核細胞表面特異性分子CDl4表達增強，同時使單核細胞表面、在免疫應答中發(fā)揮重要作用的第二信號分子CD86 分子表達也明顯增加[22]。當歸多糖作用于巨噬細胞后可使IL-2，白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4），白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6），和 IFN-γ 表達增加，IL-6 和 IFN-γ 增加迅速，IL-2 的增加要稍后一些。表明首先作用于非特異性免疫細胞如巨噬細胞和NK 細胞，隨后影響輔助T細胞，同時對B 細胞也具有潛在的活化作用，增加抗體的產(chǎn)生[23]。

中藥配伍傳統(tǒng)意義，在中醫(yī)臨床上，基于病情需要根據(jù)藥性的特點配伍使用，不是藥物的簡單相加，是以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)，辨證論治，并結(jié)合中藥藥性理論，遵守“君臣佐使”的配伍原則，使之成為“有制之師”，最終實現(xiàn)“整體綜合調(diào)節(jié)”的目標[24]。因此中藥藥性理論是指導中醫(yī)臨床用藥的關(guān)鍵[25]?，F(xiàn)代研究表明中藥配伍能夠?qū)⑻囟ńM分進行整合，達到多靶點、多途徑發(fā)揮藥效的作用[26]。紅景天刺激B 細胞和巨噬細胞分泌IL-12，IL-12 促進Th1 細胞分化，產(chǎn)生IFN-γ，而當歸作用于巨噬細胞，使 IL-6 和 IFN-γ 迅速增加；紅景天促進IL-2 和IL-12 的分泌彌補當歸促進IL-2 分泌的延遲和不足，說明紅景天與當歸對小鼠的免疫作用有不同的靶點。

本次實驗結(jié)果，M 組各項指標均顯著低于C 組，具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），說明本次實驗造模成立，配伍組各項指標均明顯高于M 組，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），說明紅景天與當歸配伍對免疫低下小鼠具有增強免疫的作用。本次實驗配伍組各項指標均高于R 組和A 組，其中紅景天當歸1 ∶1 配伍組各項指標高于其余各組，紅景天和當歸配伍可能產(chǎn)生了協(xié)同作用，也印證了這一點。但其具體通過何種途徑發(fā)揮作用，以及T、B 細胞在此免疫調(diào)節(jié)中的具體作用有待于今后從分子水平、體外實驗等進一步闡明。