鹽濃度、溫度和pH值對NaCl誘導的馬鈴薯直鏈淀粉自聚集行為的影響

聞燕，唐津忠，彭勃，陳昭國

（1．天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津300134；2．四川大學國家生物醫(yī)學材料工程技術研究中心，四川成都610064）

一直以來，淀粉被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等領域。淀粉的晶體結構會影響淀粉產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性[1-2]、降解性[3-4]、糊化性質[5-7]和體外消化性能[8]等。

淀粉顆粒為半結晶聚合物，最常見的晶型為A-型和B-型，均以淀粉分子雙螺旋為構筑單元[6，9-12]。淀粉分子鏈的水合情況[7，9-10，12-13]以及分子鏈間和分子鏈內的氫鍵作用[14-16]是影響淀粉晶體結構的關鍵因素。改變水-淀粉分子間的相互作用，可以破壞淀粉原來的晶體結構，導致淀粉分子雙螺旋重排形成新的晶型[9]。

鹽的存在會影響淀粉的晶體結構，可能的機理通常分為以下幾種：1）鹽分子中的陽離子與淀粉羥基之間的靜電作用[7，14，16]。2）離子的水合作用[7，12]。前期研究結果表明，鹽（NaCl、KCl）的存在可以誘導馬鈴薯直鏈淀粉結晶。淀粉濃度固定時，鹽濃度降低有利于淀粉結晶[14]。鹽分子中的陽離子與淀粉羥基及帶負電的磷酸基團之間的靜電作用，一方面可以減小磷酸基團帶來的淀粉分子內部的靜電斥力，穩(wěn)定淀粉分子的雙螺旋結構，有利于其進一步堆積形成更加有序的晶體結構。另一方面，鹽-淀粉間的靜電作用也會破壞部分淀粉分子內和分子間氫鍵。鹽濃度太高，其對氫鍵的破壞作用過強，不利于淀粉結晶。本研究采用熒光倒置顯微鏡和紅外光譜分別考察不同鹽濃度、pH 值和溫度條件下，馬鈴薯直鏈淀粉與NaCl 溶液作用不同時間的結晶形貌和化學結構變化，初步探索NaCl 誘導的馬鈴薯直鏈淀粉自聚集行為的影響因素，以期為調控淀粉產(chǎn)品的晶體結構及性能提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯淀粉（表觀直鏈淀粉含量和總直鏈淀粉含量分別為19.6%和20.2%）：赤峰天澤生物科技有限責任公司；微生物α-淀粉酶（編號：DF-L-NA 20130730，相對活性20 000 U/mL）：天津諾奧科技發(fā)展有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市四通化工廠。

1.2 儀器與設備

手提式壓力蒸汽滅菌器（YXQG02 型）：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；高速離心機（L535-1 型）：湘儀離心機儀器有限公司；熒光倒置顯微鏡（C-HGFT型）：日本 Nikon 公司；島津紅外光譜儀（IR-1 型）：上海納锘儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬鈴薯直鏈淀粉的制備

馬鈴薯直鏈淀粉按天津市食品生物技術重點實驗室的方法自制[14]。

1.3.2 馬鈴薯直鏈淀粉懸液的配制

稱取0.4 g 干燥的馬鈴薯直鏈淀粉分散于10 mL 不同濃度的 NaCl 溶液中（濃度分別為1、0.5、0.1、0.05 mol/L）。室溫（25 ℃）下充分搖勻，分別于 15 min、0.5、1、2、4、6、12、24 h 后離心，收集上清液。一部分上清液供熒光倒置顯微鏡檢測用。另外一部分上清液于60 ℃烘箱中干燥，供紅外檢測用。以不加NaCl 的馬鈴薯直鏈淀粉懸液作對照。

考察溫度對NaCl 誘導的馬鈴薯直鏈淀粉自聚集行為的影響時，樣品制備方法與上述方法相似，只是固定NaCl 溶液的濃度為0.1 mol/L，淀粉懸浮液充分搖勻后置于4 ℃冰箱中存放，收集上清液，備用。以室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉懸液作對照。

考察pH 值對NaCl 誘導的馬鈴薯直鏈淀粉自聚集行為的影響時，固定NaCl 溶液的濃度為0.1 mol/L，分別用0.01 mol/L HCl 溶液和0.01 mol/L NaOH 溶液將其pH 值調至pH 5.0 和pH 8.0。按照上述方法制備不同pH 值條件下馬鈴薯直鏈淀粉懸液，收集上清液，備用。以不調pH 值的馬鈴薯直鏈淀粉懸液（pH 6.5）作對照。

1.3.3 熒光倒置顯微鏡檢測

用一次性膠頭滴管滴2 滴馬鈴薯直鏈淀粉上清液（質量分數(shù)4%）于潔凈的載玻片上，室溫（25 ℃）下自然晾干。采用熒光倒置顯微鏡觀察上清液中淀粉的結晶形貌。

1.3.4 紅外光譜檢測

采用KBr 壓片法使用島津IR-1 型紅外光譜儀分析不同條件下制得的馬鈴薯直鏈淀粉樣品的紅外光譜。掃描次數(shù)為256 次，分辨率為2 cm-1，波長范圍為4 000 cm-1～500 cm-1。

2 結果與分析

2.1 鹽濃度對馬鈴薯直鏈淀粉自聚集行為的影響

室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉與0.1 mol/L NaCl溶液作用不同時間的紅外譜圖見圖1。

圖1 室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉與0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同時間的紅外譜圖Fig.1 FTIR spectra of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl for different time at room temperature（25 ℃）

位于1 045 cm-1附近的特征峰與淀粉的有序結構/結晶區(qū)有關[17-18]。與原馬鈴薯直鏈淀粉相比，NaCl 存在條件下，所有馬鈴薯直鏈淀粉樣品在1 045 cm-1附近的特征峰強度增加，表明NaCl 的加入可以誘導馬鈴薯直鏈淀粉分子重排形成更加有序的結構。另外，位于3 433 cm-1

和1 644 cm-1附近的特征吸收峰分別歸屬于羥基的伸縮振動峰和水分子中羥基的彎曲振動峰強度也普遍增加。這是因為帶正電的Na+可以與馬鈴薯直鏈淀粉分子鏈上的羥基之間發(fā)生靜電作用，并影響其與晶體內部水分子之間的相互作用，導致羥基吸收峰發(fā)生變化。這種鹽-淀粉間的靜電作用破壞了部分馬鈴薯直鏈淀粉分子內及分子間氫鍵，也在一定程度上影響了馬鈴薯直鏈淀粉-水分子之間的相互作用[14]。而淀粉分子內及分子間氫鍵[14-16]，以及淀粉-水分子相互作用[7，9-10，12-13]是影響淀粉分子雙螺旋重新排列形成有序的聚集體或晶體結構的重要因素。改變NaCl的濃度，所得馬鈴薯直鏈淀粉的紅外譜圖上特征吸收峰的變化趨勢一致（試驗結果未給出）。因此，紅外譜圖的試驗結果在一定程度上證實了NaCl 的加入可以誘導馬鈴薯直鏈淀粉分子雙螺旋重排，形成淀粉聚集體。

采用熒光倒置顯微鏡可以直觀、方便地觀察馬鈴薯直鏈淀粉與NaCl 溶液作用不同時間的結晶形貌，是考察NaCl 誘導的馬鈴薯直鏈淀粉自聚集行為的一種有效手段。

室溫（25 ℃），與0.05 mol/L NaCl（pH 值約為6.5）分別作用 15 min，0.5、1、2、4、6、12、24 h 后馬鈴薯直鏈淀粉的結晶形貌見圖2。

圖2 室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉與0.05 mol/L NaCl 溶液作用不同時間的熒光倒置顯微鏡圖片F(xiàn)ig.2 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.05 mol/L NaCl for different time at room temperature（25 ℃）

由圖2 可以看出，原馬鈴薯直鏈淀粉以淀粉顆粒的形式存在（圖2I），NaCl 的存在誘導馬鈴薯直鏈淀粉形成了高度有序的聚集體。馬鈴薯直鏈淀粉分子先形成有序的小的繩狀聚集體，并有短枝狀聚集體垂直于其長軸方向平行堆積（圖2 A2）。小的繩狀聚集體進一步堆積成十字形聚集體（圖2 D2、E2、F2）。十字形聚集體繼續(xù)生長，最終形成中間有十字、長繩狀聚集體垂直于晶體生長的長軸方向平行堆積的更大的規(guī)則聚集體（圖 2 G2、H2）。與 0.05 mol/L NaCl 作用 12 h 后，馬鈴薯直鏈淀粉的結晶形貌基本不變。

室溫（25 ℃），與0.1 mol/L NaCl（pH 值約為6.5）分別作用 15 min、0.5、1、2、4、6、12、24 h 后馬鈴薯直鏈淀粉的結晶形貌見圖3。

與0.05 mol/L NaCl 溶液相類似，在0.1 mol/L NaCl溶液中，馬鈴薯直鏈淀粉形成了高度有序的聚集體（圖3），只是晶體生長速度更快。與0.1 mol/L NaCl 溶液作用0.5 h 后就觀察到了高度有序的規(guī)則聚集體（圖3 B2），中間有十字，長繩狀聚集體垂直于晶體生長的長軸方向平行堆積，長繩狀聚集體的末端連接有小的樹狀聚集體（圖3 B1）。與0.1 mol/L NaCl 溶液作用4 h以后，馬鈴薯直鏈淀粉的結晶形貌基本不變。

圖3 室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉與0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同時間的熒光倒置顯微鏡圖片F(xiàn)ig.3 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl for different time at room temperature（25 ℃）

室溫（25 ℃），分別與0.5 和1 mol/L NaCl（pH 值約為 6.5）分別作用 15 min，0.5、1、2、4、6、12、24 h 后馬鈴薯直鏈淀粉的結晶形貌見圖4 和圖5。

圖4 室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉與0.5 mol/L NaCl 溶液作用不同時間的熒光倒置顯微鏡圖片F(xiàn)ig.4 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.5 mol/L NaCl for different time at room temperature（25 ℃）

圖5 室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉與1 mol/L NaCl 溶液作用不同時間的熒光倒置顯微鏡圖片F(xiàn)ig.5 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 1 mol/L NaCl for different time at room temperature（25 ℃）

當NaCl 溶液濃度高于0.1 mol/L 時，NaCl 仍然可以誘導馬鈴薯直鏈淀粉形成高度有序的聚集體（圖4和圖5），只是與0.1 mol/L NaCl 溶液相比，馬鈴薯直鏈淀粉晶體生長速度明顯減慢。與NaCl 溶液作用24 h以后，馬鈴薯直鏈淀粉的結晶形貌基本不變。

圖6 給出了馬鈴薯直鏈淀粉與不同濃度的NaCl溶液作用6 h 后的熒光倒置顯微圖。

圖6 室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉與不同濃度的NaCl 溶液作用6 h 的熒光倒置顯微鏡圖片F(xiàn)ig.6 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites after 6 h treatment with NaCl at different concentrations at room temperature（25 ℃）

當NaCl 溶液濃度為0.1 mol/L 時，馬鈴薯直鏈淀粉的晶體生長速度最快（圖6 C、D）。NaCl 溶液濃度過高或過低時，馬鈴薯直鏈淀粉聚集體均未充分生長。馬鈴薯直鏈淀粉聚集體由其分子雙螺旋堆積而成。NaCl 誘導的馬鈴薯直鏈淀粉自聚集行為主要由Na+與淀粉分子鏈上的羥基和帶負電的磷酸基團之間的靜電作用來調控。在NaCl 溶液中，Na+與淀粉分子鏈上帶負電的磷酸基團間的靜電作用可以屏蔽淀粉分子內部的靜電斥力，有利于形成穩(wěn)定的雙螺旋結構，進而堆積成結構更為致密的有序的淀粉聚集體[14]。由于鹽的靜電屏蔽作用，KCl 對聚核苷酸的螺旋結構及晶體結構產(chǎn)生了類似的影響[19-20]。另一方面，Na+也會通過靜電作用與馬鈴薯直鏈淀粉分子鏈上的羥基結合，破壞部分淀粉分子內和分子間氫鍵[14]，與紅外光譜的試驗結果相一致。氫鍵的破壞也會干擾馬鈴薯直鏈淀粉分子聚集過程中雙螺旋的重新排布。因此，隨NaCl 溶液濃度增大，Na+與馬鈴薯直鏈淀粉分子鏈上的磷酸基團間的靜電作用增強，對淀粉分子內部靜電斥力的屏蔽作用增強，有利于淀粉分子雙螺旋堆積成有序的聚集體。當NaCl 溶液濃度過高時（在本試驗濃度范圍內，最佳濃度為0.1 mol/L），Na+與淀粉羥基的靜電作用過強，對淀粉分子內和分子間氫鍵的破壞作用過強，不利于淀粉分子雙螺旋進一步堆積成有序的聚集體。因此，馬鈴薯直鏈淀粉在0.1 mol/L NaCl 溶液中晶體生長速度最快，作用4 h 后結晶形貌基本不變。

2.2 溫度對馬鈴薯直鏈淀粉自聚集行為的影響

4 ℃下馬鈴薯直鏈淀粉與0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同時間的紅外譜圖見圖7。

4 ℃下馬鈴薯直鏈淀粉紅外譜圖上，與馬鈴薯直鏈淀粉的有序結構/結晶區(qū)有關的特征吸收峰（1 046 cm-1附近）、羥基的伸縮振動峰（3 425 cm-1附近）和水分子中羥基的彎曲振動峰（1 646 cm-1附近）的強度普遍比原淀粉強，測試結果與室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉紅外譜圖（圖3）類似，只是特征峰的位置發(fā)生了一定程度的移動。隨著溫度的降低，馬鈴薯直鏈淀粉分子的鏈段運動減慢，Na+-淀粉間的靜電作用發(fā)生一定程度的改變，因此，與室溫（25 ℃）相比，4 ℃下馬鈴薯直鏈淀粉紅外譜圖上與有序結構相關的特征吸收峰，以及羥基伸縮振動峰和水分子中羥基彎曲振動峰的位置發(fā)生一定程度的移動。紅外測試結果表明，4 ℃下NaCl 的存在破壞了部分馬鈴薯直鏈淀粉分子內及分子間氫鍵，也在一定程度上影響了馬鈴薯直鏈淀粉-水分子之間的相互作用，可以誘導馬鈴薯直鏈淀粉分子重排，形成有序的淀粉聚集體。

圖7 4 ℃下馬鈴薯直鏈淀粉與0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同時間的紅外光譜圖Fig.7 FTIR spectra of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl for different time at 4 ℃

4 ℃下，與 0.1 mol/L NaCl 溶液（pH 6.5）分別作用15 min、0.5、1、2、4、6、12、24 h 后馬鈴薯直鏈淀粉的結晶形貌見圖8。

圖8 4 ℃下馬鈴薯直鏈淀粉與0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同時間的熒光倒置顯微鏡圖片F(xiàn)ig.8 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl for different time at 4 ℃

與室溫（25 ℃）（圖3）相比，馬鈴薯直鏈淀粉在4 ℃下的晶體生長速度明顯減慢。與0.1 mol/L NaCl 溶液作用6 h 后，可以觀察到高度有序、中間有十字、長繩狀聚集體垂直于晶體生長的長軸方向平行堆積的大的規(guī)則聚集體，但是長繩狀聚集體的末端連接有小的樹狀聚集體（圖8 F2）。與0.1 mol/L NaCl 溶液作用24 h 以后，馬鈴薯直鏈淀粉的結晶形貌基本不變。這是因為隨著溫度的降低，馬鈴薯直鏈淀粉分子鏈段運動減慢，Na+-淀粉間的靜電作用對淀粉分子雙螺旋重排形成高度有序的聚集體的促進作用降低，晶體生長速度減慢。

2.3 pH值對馬鈴薯直鏈淀粉自聚集行為的影響

室溫（25 ℃）下，馬鈴薯直鏈淀粉與不同pH 值的0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同時間的紅外譜見圖9。

圖9 室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉與不同pH 值的0.1 mol/L NaCl 溶液作用不同時間的紅外光譜圖Fig.9 FTIR spectra of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl at different pH values for different time at room temperature（25 ℃）

室溫（25 ℃）pH 5（圖 9 A）和 pH 8（圖 9 B）條件下，與原淀粉相比，與馬鈴薯直鏈淀粉有序結構/結晶區(qū)有關的特征吸收峰、羥基的伸縮振動峰和水分子中羥基的彎曲振動峰的強度普遍增強。pH 值改變，上述特征峰的位置發(fā)生一定程度的移動。在pH 5 下，馬鈴薯直鏈淀粉分子鏈上的羥基發(fā)生一定程度的質子化，其與Na+間的靜電引力作用減弱。pH 值升至8 時，在弱堿性條件下，馬鈴薯直鏈淀粉分子鏈上的羥基會部分解離帶負電，其與Na+間的靜電引力作用增強。pH 值的改變，導致馬鈴薯直鏈淀粉分子鏈上的羥基與Na+間的靜電引力作用發(fā)生改變，因此，紅外譜圖上上述特征峰的位置會發(fā)生一定程度的移動。紅外測試結果說明，pH 值的改變使得NaCl 對馬鈴薯直鏈淀粉分子內及分子間氫鍵的破壞程度，以及對馬鈴薯直鏈淀粉-水分子之間的相互作用的影響不同，在一定程度上證實了pH 值的改變會影響NaCl 誘導的馬鈴薯直鏈淀自聚集行為。

室溫（25 ℃）下，與不同 pH 值的 0.1 mol/L NaCl 溶液分別作用 15 min、0.5、1、2、4、6、12、24 h 后馬鈴薯直鏈淀粉的結晶形貌見圖10（pH 5）和圖 11（pH 8）。

隨著NaCl 溶液的pH 值從5 升高到8，馬鈴薯直鏈淀粉晶體生長的速度加快。pH 5 條件下，與0.1 mol/L NaCl 溶液作用6 h 以后，馬鈴薯直鏈淀粉的結晶形貌基本不變（圖 10 F1、F2）。pH 值升至 6.5 和 8 時，馬鈴薯直鏈淀粉的結晶形貌基本不變需要的作用時間分別縮短至 4 h（圖3 E1、E2）和 0.5 h（圖 11 B1、B2）。在pH 5 下，馬鈴薯直鏈淀粉分子鏈上的羥基發(fā)生部分質子化，其與Na+間的靜電引力作用減弱，對淀粉分子間和分子內的氫鍵破壞作用減弱；同時，質子化的羥基也會屏蔽一部分磷酸基團帶來的淀粉分子內靜電斥力，有利于形成穩(wěn)定的淀粉雙螺旋結構。相反，pH 值升高至弱堿性時，馬鈴薯直鏈淀粉分子鏈上的羥基發(fā)生部分脫質子化而帶負電，其與Na+間的靜電引力作用增強，對淀粉分子間和分子內的氫鍵破壞作用增強；同時，脫質子化的羥基也增強淀粉分子內靜電斥力，不利于形成穩(wěn)定的淀粉雙螺旋結構。但是，隨pH 值升高，馬鈴薯直鏈淀粉晶體生長的速度反而加快。原因可能是，隨NaCl 溶液的pH 值升高，馬鈴薯直鏈淀粉自聚集過程中淀粉-水分子相互作用發(fā)生改變，更易形成結構有序的聚集體。

3 結論

NaCl 的存在可以誘導馬鈴薯直鏈淀粉分子雙螺旋重新排布，最終形成高度有序、中間呈明顯十字、長繩狀聚集體垂直于晶體生長的長軸方向平行堆積的大的規(guī)則聚集體。馬鈴薯直鏈淀粉在NaCl 溶液中發(fā)生自聚集的主要推動力為Na+與淀粉分子鏈上帶負電的磷酸基團和自由羥基之間的靜電作用。這種靜電作用會降低淀粉分子鏈內部的靜電斥力，也會破壞部分淀粉分子內和分子間氫鍵，還會影響淀粉自聚集過程中淀粉-水分子間的相互作用。

圖10 室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉與0.1 mol/L NaCl 溶液（pH 5）作用不同時間的熒光倒置顯微鏡圖片F(xiàn)ig.10 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl（pH 5）for different time at room temperature（25 ℃）

圖11 室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉與0.1 mol/L NaCl 溶液（pH 8）作用不同時間的熒光倒置顯微鏡圖片F(xiàn)ig.11 Representative optical micrographs of potato amylose crystallites treated with 0.1 mol/L NaCl（pH 8）for different time at room temperature（25 ℃）

NaCl 溶液濃度為 0.1 mol/L 時，室溫（25 ℃）下馬鈴薯直鏈淀粉分子最易形成結構有序的聚集體，作用4 h 后，其結晶形貌基本不變；濃度過高或過低，其結晶形貌基本不變所需的時間延長。降低溫度，馬鈴薯直鏈淀粉分子鏈段運動減慢，Na+-淀粉間的靜電作用對淀粉聚集的促進作用降低，晶體生長速度減慢。在pH8的弱堿性條件下，馬鈴薯直鏈淀粉分子鏈上的羥基發(fā)生部分脫質子化，可能導致淀粉自聚集過程中淀粉-水分子相互作用發(fā)生改變，更易形成結構有序的聚集體。