糖尿病腎病足細胞損傷的表觀遺傳調(diào)控

周 樂 郭兆安 綜述 李 偉 審校

表觀遺傳修飾是指在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達水平和功能發(fā)生可遺傳的改變，包括DNA甲基化、組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾、非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)。表觀遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致了靶細胞高糖“代謝記憶”的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致了糖尿病腎病(DN)等并發(fā)癥，而足細胞損傷是DN進展的核心事件，因此，探索足細胞損傷的表觀遺傳調(diào)控機制，對于DN的診療意義重大。

DNA甲基化

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的催化下將甲基轉(zhuǎn)移給啟動子區(qū)CpG島的胞嘧啶5’-碳原子，形成甲基化的胞嘧啶，阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合以抑制轉(zhuǎn)錄[2]。目前研究已發(fā)現(xiàn)高糖微環(huán)境導(dǎo)致的DNA甲基化改變在DN的病程進展中發(fā)揮了重要作用。

足細胞結(jié)構(gòu)DNA甲基化異?？筛淖冏慵毎Y(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。足細胞裂孔膜上的跨膜蛋白nephrin和podocin對維持足細胞裂孔膜的正常功能及足突的完整性非常重要。高糖可造成多種因子的表達發(fā)生變化，進而通過干擾nephrin啟動子甲基化水平對足細胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。例如，DN動物模型的足細胞中轉(zhuǎn)錄因子Kruppel樣因子4 (KLF4)表達減少， KLF4過表達可導(dǎo)致nephrin啟動子區(qū)域的去甲基化，從而增加nephrin啟動子活性。同時，編碼間充質(zhì)標志物-波形蛋白的啟動子甲基化增加，進而抑制波形蛋白的表達[3]。因此，足細胞表觀基因組可作為直接干預(yù)靶標來減少蛋白尿。

賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT5介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)對足細胞維持正常的功能至關(guān)重要，DN足細胞中KAT5表達減少，而DNA雙鏈斷裂和甲基化增加，通過基因轉(zhuǎn)移恢復(fù)KAT5可減弱蛋白尿，同時，KAT5在相同的nephrin啟動子區(qū)域減少DNA雙鏈斷裂和甲基化，表明KAT5介導(dǎo)的DNA修復(fù)可能與DNA甲基化狀態(tài)有關(guān)，KAT5可能是DN的治療靶點[4]。

DNA甲基化主要受DNMTs的調(diào)節(jié)，其中DNMT1的主要作用是維持DNA復(fù)制時的甲基化水平，DNMT1的表達水平、活性及其與基因啟動子區(qū)的結(jié)合均可能影響對靶基因的調(diào)控。高糖可使小鼠足細胞DNMT1蛋白表達增加同時減少nephrin、podocin的表達，經(jīng)DNA甲基化抑制劑處理后，兩種膜蛋白表達上調(diào)，提示降低DNMT1對高糖刺激下的足細胞具有保護作用，抑制DNA甲基化或許是DN的另一種治療方法[5]。

足細胞凋亡目前已發(fā)現(xiàn)多個足細胞基因的表達受到表觀遺傳選擇性調(diào)節(jié)，從而直接或間接的影響足細胞功能。有研究對暴露于高糖條件下的足細胞中進行了DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析[6]，發(fā)現(xiàn)谷氨酸離子型受體AMPA型亞基3(GRIA3)的表達受到抑制，而DNMT抑制劑可消除這種抑制。通過GRIA3啟動子區(qū)域的測序也證實了DNA高甲基化的位點，GRIA3的敲低加劇了足細胞凋亡。這些結(jié)果表明了糖尿病患者足細胞GRIA3因DNA甲基化變化而表達下調(diào)，進而促進了足細胞凋亡和丟失。

DNA甲基化與足細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是DN足細胞損傷的重要形式，表現(xiàn)為正常的上皮細胞標志物表達減少，而間充質(zhì)細胞標志物表達增加?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)的異常表達與DN足細胞EMT相關(guān)。高糖處理足細胞可上調(diào)MMP9、α-肌動蛋白和纖連蛋白-1的表達，同時下調(diào)糖萼蛋白的表達，MMP9啟動子區(qū)域顯示含有多種去甲基化的CpG位點，且高糖處理降低了MMP9啟動子甲基化的速率。由此，MMP9啟動子的去甲基化狀態(tài)或可作為DN的重要預(yù)后標志物[7]。

由此推測，從DNA 甲基化角度干預(yù)DN，一方面需要進一步剖析DNA甲基化的啟動、擴展及消除的規(guī)律，明確作用靶點，另一方面可嘗試通過改變DNMTs的水平或活性等方法改變關(guān)鍵基因啟動子區(qū)甲基化， 從而延緩DN進程。

組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾

組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾在腎臟病領(lǐng)域的作用逐漸受到關(guān)注，目前研究最多的是發(fā)生在組蛋白H3和H4的一些特定氨基酸殘基上的乙?；图谆揎?圖1)。

圖1 糖尿病腎病足細胞損傷的表觀遺傳修飾示意圖

足細胞自噬及炎癥損傷組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶(HDACs)在DN進程中發(fā)揮了重要作用。HDACs有多個亞型，不同亞型分布及作用不盡相同，其中HDAC4在促進足細胞炎性反應(yīng)及調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)方面具有關(guān)鍵作用。HDAC4通過降低信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1) 的乙?；?激活相應(yīng)炎性基因的轉(zhuǎn)錄與表達,抑制足細胞自噬并加劇炎性反應(yīng)，導(dǎo)致足細胞損傷[8]。HDAC9在高糖處理的小鼠足細胞中表達顯著上調(diào)，而敲低HDAC9后則發(fā)現(xiàn)其通過Janus激酶2/STAT3途徑顯著抑制高糖誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生，抑制了細胞凋亡和炎癥[9]。這些研究提示了HDAC的改變會影響DN的進展，而抑制HDAC可能是DN的潛在治療方法。例如，HDAC抑制劑VPA可通過干預(yù)核因子κB(NF-κB)介導(dǎo)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(eNOS)活化,促進自噬，改善足細胞損傷[10]。

Sirtuins(SIRT)家族屬于Ⅲ類HDAC，共有SIRT1- SIRT7七個成員，目前研究已發(fā)現(xiàn)SIRT1和SIRT6在減輕DN足細胞損傷中發(fā)揮了重要作用。SIRT1具有保護腎小球濾過屏障、抗氧化應(yīng)激、抗腎纖維化以及調(diào)節(jié)線粒體功能和能量代謝的作用。SIRT1可下調(diào)足細胞中緊密連接蛋白Claudin-1的表達，后者進一步下調(diào)縫孔蛋白從而造成足細胞脫落[11]。足細胞特異性敲除SIRT1能夠加重蛋白尿和腎臟損傷,SIRT1通過影響NF-κB的p65亞型和STAT3乙酰化水平,加重足細胞炎癥反應(yīng)，使用乙?；种苿┳钄鄍65和STAT3的乙?；?，蛋白尿和腎損傷減輕，由此推斷靶向蛋白乙酰化可能是DN的潛在療法[12]。

Sirt6在足細胞中也發(fā)揮了多重保護作用，包括抗炎、抗細胞凋亡、穩(wěn)定細胞骨架及促進足細胞自噬。Sirt6可通過Notch信號傳導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控——改變Notch1和Notch4啟動子區(qū)域H3K9位點的乙?；?，抑制Notch1和Notch4轉(zhuǎn)錄以及下游信號通路的激活,增加自噬通量，從而保護足細胞免于凋亡和炎癥[13]。Sirt6還可降低尿激酶纖溶酶原激活物受體的表達，后者是足細胞足突消失和蛋白尿的關(guān)鍵因素。

足細胞損傷組蛋白甲基化由組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶(HMTs)如 Ezh2、 PRC、 SET7 介導(dǎo)，組蛋白甲基化比乙?；臃€(wěn)定和持久。高糖可通過誘導(dǎo)EZH2的表達下調(diào)，促進轉(zhuǎn)錄因子Pax6啟動子的H3K27me3上調(diào)，繼而減弱了對Pax6的抑制作用，致使內(nèi)源性抗氧化抑制劑硫氧還蛋白互作蛋白的表達升高，加劇足細胞氧化應(yīng)激[14]。Set7為特異性的單甲基化酶靶向作用于H3K4，且Set7富集于NF-κB p65基因的啟動子區(qū)激活轉(zhuǎn)錄，若沉默或敲除Set7，則高糖無法誘導(dǎo)p65基因的高表達。，表明高糖致NF-κB表達增加可能是通過Set7催化H3K4實現(xiàn)的[15]。

非編碼RNA

非編碼RNA(ncRNA)是不被翻譯成蛋白質(zhì)的一類功能性RNA[16]，可在多個遺傳學(xué)層面調(diào)控基因表達，影響DN進程。目前的研究文獻中，ncRNA對DN足細胞損傷的影響研究最多，是檢出率最高的表觀遺傳調(diào)控方式。ncRNA分兩類，其一是短鏈ncRNA，主要為微小RNA( microRNAs，miRNA)，另一是長鏈ncRNA(long non-coding RNA，LncRNA)。

lncRNA與足細胞損傷lncRNA在DN病理機制中的作用越來越被關(guān)注。已證實有數(shù)百種lncRNA在DN中失調(diào)，并且這些lncRNA可能通過調(diào)節(jié)多種分子途徑而促成DN的發(fā)生發(fā)展。

lncRNA對足細胞凋亡及自噬具有調(diào)控作用。lncRNA Gm5524和Gm15645可能通過調(diào)節(jié)DN中的B淋巴細胞瘤-2/BCL2家族成員BAX(Bcl2/BAX)和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 /自噬相關(guān)蛋白(LC3/Atg)信號通路影響足細胞凋亡和自噬過程。在敲低Gm5524和過表達Gm15645的足細胞中，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，而促凋亡蛋白Bax表達增加。另外，Gm5524和Gm15645的表達改變也影響了確定自噬激活的標記物(LC3II/LC3I)。因此，Gm5524和Gm15645介導(dǎo)的自噬和凋亡信號通路的調(diào)節(jié)可能是開發(fā)DN替代治療策略的潛在靶點[17]。

lncRNA參與了足細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙。LINC01619在足細胞胞質(zhì)中表達并參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路。在糖尿病大鼠和高糖培養(yǎng)的足細胞中，LINC01619作為競爭性內(nèi)源性RNA，通過調(diào)節(jié)DN中miR-27a/叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(FOXO1)信號通路，觸發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和足細胞損傷，使足細胞凋亡增加和足突彌漫性消失[18]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)共激活因子α(PGC-1α)在線粒體生物能量學(xué)和呼吸中具有核心作用，是線粒體功能障礙和DN進展的關(guān)鍵介質(zhì)，其在糖尿病中表達通常是降低的， LncTUG1通過與足細胞中的PGC-1α之間的相互作用，促進了PGC-1α與其自身啟動子的結(jié)合，使PGC-1α轉(zhuǎn)錄表達增加，從而改善足細胞線粒體生物能量學(xué)[19]。

lncRNA通過調(diào)控足細胞EMT及影響細胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致足細胞損傷。lncRNA ENSRNOG00000037522在DN足細胞EMT中起關(guān)鍵作用，敲低ENSRNOG00000037522可通過調(diào)節(jié)波形蛋白、糖萼蛋白和nephrin表達而修復(fù)足細胞損傷[20]。β連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt信號通路中的關(guān)鍵介質(zhì)，其異常表達促進了足細胞功能障礙和蛋白尿發(fā)生并導(dǎo)致腎纖維化。lncRNA MALAT1在DN中表達增加，致使β-catenin轉(zhuǎn)位至細胞核，增強MALAT1連接蛋白絲氨酸/精氨酸剪接因子1(SRSF1)的表達，使p-鈣黏蛋白和緊密連接蛋白ZO-1的表達降低，引發(fā)足細胞結(jié)構(gòu)損傷，研究同時發(fā)現(xiàn)β-catenin通過與MALAT1的啟動子區(qū)域結(jié)合參與了MALAT1轉(zhuǎn)錄，β-catenin敲低也降低了MALAT1水平，表明MALAT1和β-catenin之間存在新的反饋調(diào)節(jié)。這些發(fā)現(xiàn)為MALAT1在DN和高糖誘導(dǎo)的足細胞損傷中的關(guān)鍵作用提供了證據(jù)[21]。

miRNA與足細胞損傷miRNA在DN中的作用研究較多，miRNA通過不同分子和信號傳導(dǎo)途徑參與了DN進程中細胞凋亡、纖維化和細胞外基質(zhì)積聚等過程[22]。miRNA也參與了足細胞損傷的機制，或促進細胞損傷進程，或起保護作用。

部分miRNA的表達上調(diào)會促進足細胞損傷進程。miR-29c在暴露于高糖條件的小鼠足細胞中上調(diào)，且 miR-29c的上調(diào)與炎性細胞因子的增加呈正相關(guān)，miR-29c直接靶向TTP并加重DN炎癥反應(yīng)[23]。 miR-27a通過PPARγ/β-catenin信號軸介導(dǎo)了DN足細胞損傷。高糖刺激使miR-27a表達增加，通過負向靶向PPARγ，激活β-catenin信號傳導(dǎo)，并且下調(diào)足細胞podocin和特異性突觸連接蛋白的表達，從而損傷足細胞[24]。miR-21通過調(diào)節(jié)磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)增加足細胞運動性。miR-21的體內(nèi)和體外抑制消除了大多數(shù)DN表現(xiàn)，包括系膜擴張、間質(zhì)纖維化、足細胞消失和蛋白尿[25]。miR-218在高糖處理的足細胞中表達水平升高，其通過下調(diào)血紅素氧合酶1(HO-1)及促進p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)的激活引發(fā)了足細胞凋亡[26]。還有一些miRNA則具有足細胞保護作用(表1)。

表1 非編碼RNA參與糖尿病腎病足細胞損傷的機制

Atg：自噬相關(guān)基因； Bcl2:B淋巴細胞瘤2;Bax：BCL2家族成員；LC3：微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；FOXO1：叉頭轉(zhuǎn)錄因子1；SRSF1：絲氨酸/精氨酸剪接因子1；β-catenin：β連環(huán)蛋白；PPARγ:過氧化物酶體增殖激活受體 γ;PGC-1α： PPARγ共激活因子α；PTEN:磷酸酶及張力蛋白同源體; HO-1:血紅素氧合酶 1; p38-MAPK:p38 絲裂原活化蛋白激酶;MTDH:異黏蛋白; HDAC4:去乙?；D(zhuǎn)移酶4;EMT:上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化;SRSF:絲氨酸/精氨酸剪接因子1

表觀遺傳修飾間相互作用

三種表觀遺傳方式對DN的調(diào)控并不是獨立的，而是存在交叉對話、相互調(diào)控的作用。ncRNA受到組蛋白修飾和DNA甲基化的修飾，同時，ncRNA也可通過影響表觀遺傳過程中的關(guān)鍵酶HDAC、DNMT，直接控制表觀遺傳，由此，ncRNA與表觀遺傳修飾之間存在雙向調(diào)控環(huán)。Fabbri等人首先發(fā)現(xiàn)miR-29家族(29a，29b和29c)可直接調(diào)節(jié)DNMT-3a和DNMT-3b并間接調(diào)節(jié)DNMT1，其他可調(diào)節(jié)DNMT的還有miR-148a/b，miR-152，miR-301，miR-302，miR-342[30]。除了DNMT之外，miRNA還調(diào)節(jié)組蛋白修飾因子，如miR-449和miR-1分別可以調(diào)節(jié)HDAC1和HDAC4，進一步發(fā)揮調(diào)控作用[31]。Lin等[32]研究發(fā)現(xiàn)，高血糖加速了足細胞損傷并減少了小鼠腎小球中的nephrin、乙?；痭ephrin和miR-29a的水平，強化了HDAC4的作用，而miR-29a的過度表達減弱了HDAC4信號傳導(dǎo)，恢復(fù)了nephrin乙?；妥慵毎€(wěn)態(tài)。在敲除miR-29后則出現(xiàn)了完全相反的結(jié)果。在體外，HDAC4信號傳導(dǎo)的中斷減輕了足細胞凋亡和對nephrin乙酰化的抑制， HDAC4本身通過miRNA的啟動子區(qū)域中的H3K9Ac的低乙?；癄顟B(tài)，減少miR-29a的表達[31]。由此可見，增加miR-29a可維持足細胞微環(huán)境中乙?；磻?yīng)，預(yù)防糖尿病足細胞損傷。另外還發(fā)現(xiàn)，miR-155敲減可促進nephrin乙?；p輕高糖誘導(dǎo)的腎損傷[32]。miR-93過表達降低了高血糖誘導(dǎo)的足細胞中H3K14Ac的乙?；?，從而阻止足細胞損傷[33]。

小結(jié):表觀遺傳修飾是DN的重要機制之一，不同表觀遺傳修飾之間通過交叉對話、相互作用，參與足細胞損傷過程，同時，表觀遺傳又是可逆的，通過治療干預(yù)來改變表觀遺傳修飾可能是防治DN的一個重要方向。未來需要通過基因組學(xué)全面分析足細胞損傷的表觀遺傳修飾情況，在此基礎(chǔ)上進一步研制特異性表觀遺傳調(diào)控藥物，為DN治療開辟新途徑。