靶向清除B細(xì)胞治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡

張 倜 綜述 張 炯 審校

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE) 是一種病因不明、高度異質(zhì)性的自身免疫性疾病，目前對SLE的發(fā)病機(jī)制理解為在易感基因、性激素、環(huán)境綜合作用下，機(jī)體無法有效清除含有核酸的凋亡碎片，激活固有免疫細(xì)胞釋放干擾素α (IFN-α),進(jìn)而導(dǎo)致適應(yīng)性免疫耐受的丟失，表現(xiàn)為T細(xì)胞、B細(xì)胞的功能亢進(jìn)、信號傳導(dǎo)通路紊亂，形成免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體導(dǎo)致組織損傷[1-2]。其中B細(xì)胞的功能異常被認(rèn)為是SLE發(fā)病機(jī)制的核心環(huán)節(jié)，深入探索B細(xì)胞的功能可給SLE提供新的治療策略[3]。

B細(xì)胞在SLE中通過細(xì)胞固有功能、抗體介導(dǎo)及T細(xì)胞依賴的機(jī)制發(fā)揮作用。自身反應(yīng)性B細(xì)胞活化后生成自身抗體，介導(dǎo)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)以及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。B細(xì)胞作為鏈接固有免疫和適應(yīng)性免疫重要的媒介，起到抗原遞呈以及共刺激T細(xì)胞的作用，此外，B細(xì)胞的活化和效應(yīng)功能受到共刺激分子、信號傳導(dǎo)通路、細(xì)胞因子的精細(xì)調(diào)節(jié)[4-5]。本文就B細(xì)胞及B細(xì)胞耗竭理論在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用研究作一綜述，并進(jìn)一步探討嵌合抗原受體T細(xì)胞療法 (CAR-T) 治療SLE的可行性及前景性。

B細(xì)胞在SLE發(fā)病機(jī)制中的作用

B細(xì)胞數(shù)量及信號傳導(dǎo)異常與SLE發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。如在活動(dòng)性SLE外周血中發(fā)現(xiàn)初始B細(xì)胞減少，關(guān)鍵蛋白如Syk、Btk的磷酸化水平升高，致B細(xì)胞的高反應(yīng)性，產(chǎn)生自身抗體、協(xié)同自身反應(yīng)性T細(xì)胞及致病性細(xì)胞因子等，促進(jìn)SLE的發(fā)病進(jìn)程。

產(chǎn)生自身抗體大量研究表明，B細(xì)胞分泌自身抗體，促進(jìn)SLE疾病進(jìn)展、組織破壞。首先，自身抗體與自身抗原形成免疫復(fù)合物沉積于組織，激活補(bǔ)體及CDC效應(yīng)，造成組織損傷[6]。其次，自身抗體通過ADCC效應(yīng)，招募效應(yīng)細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞Fc受體介導(dǎo)組織損傷。最后，免疫復(fù)合物通過Fc受體及Toll樣受體(TLRs)雙向激活效應(yīng)細(xì)胞。因此B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體，可通過多種機(jī)制介導(dǎo)SLE的組織損傷[7]。

與T細(xì)胞相互作用自身反應(yīng)性B細(xì)胞通過與T細(xì)胞相互作用促進(jìn)SLE的發(fā)病。B細(xì)胞作為表達(dá)的MHC Ⅱ類分子的抗原遞呈細(xì)胞，遞呈自身抗原激活初始CD4+T細(xì)胞，進(jìn)一步分化成濾泡輔助T細(xì)胞。在生發(fā)中心，濾泡輔助T細(xì)胞促進(jìn)B細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換，體細(xì)胞突變、分化成記憶性B細(xì)胞、漿細(xì)胞[8]。在SLE小鼠模型中，抗核抗體經(jīng)過高頻體細(xì)胞突變后，變成更高親和力、致病性的自身抗體。研究表明，SLE活動(dòng)期CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞均高表達(dá)CD40L，阻斷CD40L可緩解NZB/W狼瘡小鼠蛋白尿水平、提高預(yù)后生存[9]。

釋放細(xì)胞因子B細(xì)胞通過產(chǎn)生大量細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)。B細(xì)胞可分泌IFN-γ,白細(xì)胞介素6(IL-6),IL-2及抑炎細(xì)胞因子IL-10、IL-4。在SLE小鼠模型中，B細(xì)胞分泌IL-6及IFN-γ促進(jìn)生發(fā)中心的生存及濾泡輔助T細(xì)胞的分化。此外，IL-6可促進(jìn)B細(xì)胞生存、擴(kuò)增及分化成漿母細(xì)胞。目前多靶點(diǎn)治療(嗎替麥考酚酯聯(lián)合他克莫司)在狼瘡性腎炎治療中取得顯著療效，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)中提示B細(xì)胞相關(guān)的IL-6的信號傳導(dǎo)通路在多靶點(diǎn)治療組顯著受到明顯抑制[10]。

從上述三個(gè)方面可以看出，B細(xì)胞通過多種方式介導(dǎo)SLE的發(fā)病及進(jìn)展(圖1)。因此，靶向清除B細(xì)胞，從而抑制異常的免疫反應(yīng)，理論上成為治療SLE合理的策略。

圖2 第一代至第四代CAR-T結(jié)構(gòu)示意圖

B細(xì)胞耗竭治療的現(xiàn)狀

目前臨床上最常用造成B細(xì)胞耗竭的是第一代抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗，由鼠源性抗CD20單抗可變區(qū)Fab和人IgG1抗體恒定區(qū)Fc段構(gòu)成，主要通過補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞凋亡及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用清除B細(xì)胞。利妥昔單抗于1997年美國FDA批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)難治性濾泡性淋巴瘤的治療，目前利妥昔單抗聯(lián)合化療已成為多數(shù)B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的標(biāo)準(zhǔn)一線治療方案。

2009年EXPLORER研究納入257例無腎臟受累的中重度SLE患者，在激素、免疫抑制劑治療的基礎(chǔ)上，于第1、15、168、182天給予1 000 mg利妥昔單抗治療；2012年LUNAR研究納入144例增生型狼瘡性腎炎，在激素沖擊聯(lián)合嗎替麥考酚酯的基礎(chǔ)上，在同樣的時(shí)間點(diǎn)給予利妥昔單抗治療，但在這兩個(gè)大規(guī)模隨機(jī)對照研究中都沒有達(dá)到主要終點(diǎn)，因此利妥昔單抗并沒有獲批治療SLE的適應(yīng)癥[11-12]。

事實(shí)上，基于一些回顧性研究、臨床使用經(jīng)驗(yàn)，利妥昔單抗在治療SLE上有獨(dú)特的療效。LESIMAB研究共納入116例難治性SLE患者，72例(62.9%)在6個(gè)月的時(shí)候有療效，其中22例達(dá)到完全緩解，51例部分緩解[13]；法國的一項(xiàng)前瞻性多中心觀察研究表明，在6個(gè)月隨訪時(shí)間點(diǎn)，71%的患者利妥昔單抗治療后有療效反應(yīng)，其中腎臟反應(yīng)率為74%[14]；英國的一項(xiàng)平均隨訪4年的回顧性研究納入115例SLE患者，6個(gè)月反應(yīng)率達(dá)到67%[15]。

在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型狼瘡性腎炎臨床研究中，Condon等[18]在第1天、第15天給予1g RTX聯(lián)合500 mg甲潑尼龍沖擊治療，序貫霉酚酸酯最高劑量1.5 g/d治療。隨訪37周時(shí)，90%的患者獲得部分或完全緩解，隨訪至52周時(shí)， 52%患者完全緩解，34%患者部分緩解(表1)。進(jìn)一步分析LUNAR研究中68例利妥昔單抗治療的患者，53例(78%)患者完成了外周血B淋巴細(xì)胞完全清除,其中25例(47%)患者獲得完全緩解，而在B細(xì)胞未完全清除組中只有2例 (13%)完全緩解，提示在狼瘡性腎炎中長時(shí)間、迅速清除B細(xì)胞與完全緩解明顯相關(guān)[17]。此外，利妥昔單抗對治療SLE合并難治的溶血性貧血同樣有效。一項(xiàng)納入21例患者的觀察性研究，使用利妥昔單抗治療1月后血小板計(jì)數(shù)明顯上升，52.3%的患者獲得完全緩解，28.6%的患者獲得部分緩解[18]。因此，在2019年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟指南上仍然推薦在對免疫抑制劑治療無效或使用禁忌的重癥狼瘡性腎炎、血液系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累，以及免疫性血小板減少癥、溶血性貧血中可嘗試使用利妥昔單抗[19]。除利妥昔單抗外，Ofatumumab是全人源性Ⅰ型抗CD20單抗，目前治療增殖性狼瘡性腎炎的Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中[20]。

表1 利妥昔單抗治療SLE/LN臨床研究匯總

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；LN:狼瘡性腎炎；MP:甲潑尼龍；MMF：嗎替麥考酚酯；CTX：環(huán)磷酰胺；RTX：利妥昔單抗；a:完全有效率；*：Ⅲ、Ⅳ型

進(jìn)一步分析利妥昔單抗在SLE治療的局限性發(fā)現(xiàn)，在B細(xì)胞分化過程中，CD20只表達(dá)在前B細(xì)胞至效應(yīng)性、記憶性B細(xì)胞階段，而分泌自身抗體的漿母細(xì)胞并不表達(dá)CD20，也就意味著利妥昔單抗并不能有效清除分泌自身抗體的漿細(xì)胞[21-22]。其次，利妥昔單抗并不能有效清除骨髓、淋巴組織中的B細(xì)胞。研究表明，利妥昔單抗治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，在1月、3月分別行骨髓學(xué)流式檢查發(fā)現(xiàn)，利妥昔單抗并不能清除骨髓中分泌自身抗體的CD27(+)IgM(-)IgD(-) 記憶性B細(xì)胞，因此通過抗CD20單抗清除分泌自身抗體的B細(xì)胞/漿細(xì)胞，存在療效的不確定性[23,24]。

靶向清除B細(xì)胞的研究進(jìn)展

近年來隨著基礎(chǔ)免疫學(xué)及技術(shù)的不斷創(chuàng)新，細(xì)胞治療取得明顯的進(jìn)展，其中最為突出的嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞 (CAR-T)療法。CAR由胞外抗原結(jié)合域 (ScFV)、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)及跨膜結(jié)構(gòu)域組成。CAR-T是將能夠抗原識別結(jié)合部和胞內(nèi)信號域偶聯(lián)成一個(gè)嵌合蛋白，通過基因轉(zhuǎn)染進(jìn)T細(xì)胞，CAR-T從而具備識別細(xì)胞表面抗原的能力[25]。隨著胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的不同改造，可以將CAR-T劃分為4代。第一代CAR-T體內(nèi)存活時(shí)間短，臨床效果欠佳。第二代胞內(nèi)結(jié)構(gòu)加入T細(xì)胞共刺激分子CD28；第三代CAR-T在第二代的基礎(chǔ)上再添加一個(gè)共刺激分子，比如4-1BB，CD137等；第四代CAR-T是進(jìn)一步添加調(diào)節(jié)細(xì)胞因子相關(guān)的基因[26]。目前廣泛應(yīng)用的仍然是第二代CAR-T。機(jī)制上，CAR-T無需MHC分子限制性，直接與靶細(xì)胞高親和力結(jié)合，殺傷靶細(xì)胞。目前最為成熟的CAR-T是治療急性淋巴細(xì)胞白血病的CD19-CAR，在慢性淋巴細(xì)胞白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤中有良好的臨床反應(yīng)。大量臨床研究提示CAR-T具有良好的安全性，主要的副作用包括細(xì)胞因子釋放綜合征 (CRS)、脫靶效應(yīng)、插入突變等；CRS，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致心力衰竭、死亡[27]。目前可通過調(diào)控CAR的結(jié)構(gòu)、輸注CAR-T的數(shù)量降低CRS發(fā)生率，另外可以通過糖皮質(zhì)激素、IL-6受體單克隆抗體來降低CRS相關(guān)的并發(fā)癥[28]。

CD19廣泛的表達(dá)從前B細(xì)胞到漿細(xì)胞分化的階段。因此，通過靶點(diǎn)CD19同時(shí)可以清除分泌自身抗體的B細(xì)胞/漿細(xì)胞。近期Marko Radic使用CD19-CAR T細(xì)胞治療狼瘡小鼠模型中獲得成功[29-30]。使用CD8+T細(xì)胞構(gòu)建CD19-CART細(xì)胞，在(NZB × NZW) F1狼瘡小鼠和MRL fas/fas狼瘡小鼠體內(nèi)輸注，發(fā)現(xiàn)一部分小鼠CD19+B細(xì)胞持續(xù)清除(CD19-d)，而另外一部分小鼠CD19+B細(xì)胞在三周內(nèi)恢復(fù)(CD19-s)，進(jìn)一步比較這兩群小鼠的臨床預(yù)后，發(fā)現(xiàn)CD19-CAR T細(xì)胞注射后，CD19-d狼瘡小鼠的球蛋白水平較CD19-s狼瘡小鼠明顯下降，并且抗雙鏈DNA滴度降低至無法檢測的水平；其次，CD19-d狼瘡小鼠臨床表現(xiàn)明顯改善，蛋白尿減少，腎臟浸潤細(xì)胞、免疫復(fù)合物沉積減少；最后，B細(xì)胞過繼輸注于4個(gè)月前接受過CD19-CAR治療的狼瘡小鼠，發(fā)現(xiàn)CAR-T仍可持續(xù)清除B細(xì)胞，進(jìn)一步提示CD19-CAR在狼瘡小鼠中可以持久的、高效發(fā)揮效應(yīng)。

這項(xiàng)工作的重要意義在于其不僅在哺乳類動(dòng)物模型中驗(yàn)證了CAR-T細(xì)胞使用的安全性和可行性，還提示針對此類自身免疫性疾病，給予CD19-CAR T細(xì)胞治療可以取得免疫學(xué)指標(biāo)、組織學(xué)指標(biāo)和總體生存情況的改善，為臨床試驗(yàn)的開展提供強(qiáng)有力的理論和技術(shù)支持。

相比較利妥昔單抗，CD19-CAR T細(xì)胞的優(yōu)勢顯而易見。CD19-CAR T細(xì)胞可直接清除B細(xì)胞，而利妥昔單抗需要依賴機(jī)體ADCC，CDC等作用發(fā)揮效應(yīng)，因此CD19-CAR T細(xì)胞可以更高效的清除B細(xì)胞[31]；此外，臨床觀察發(fā)現(xiàn)利妥昔單抗輸注3月后，存在CD20+B細(xì)胞數(shù)量反彈，而這與臨床復(fù)發(fā)、治療失敗密切相關(guān)，因此利妥昔單抗治療過程中，需定期監(jiān)測B細(xì)胞數(shù)量、重復(fù)的輸注，保持B細(xì)胞低水平狀態(tài)。CD19-CAR在小鼠體內(nèi)保持活性持續(xù)1年時(shí)間，可以長時(shí)程、持續(xù)保持B細(xì)胞耗竭的狀態(tài)。此外，CD19直接參與B細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，促進(jìn)脾臟邊緣區(qū)B細(xì)胞及生發(fā)中心的B細(xì)胞的增殖、發(fā)育。CD19還表達(dá)在活化的B細(xì)胞、漿母細(xì)胞及早期的漿細(xì)胞。在SLE中，早已發(fā)現(xiàn)存在分泌自身抗體的表型為CD19+CD20-B細(xì)胞，利妥昔單抗只能清除外周血的B細(xì)胞，對CD20-的細(xì)胞無能為力，而CD19-CAR可以直接清除組織、外周血的分泌抗體的B細(xì)胞、漿細(xì)胞[32]。

當(dāng)然使用CAR-T治療SLE確實(shí)存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。首先，徹底清除B細(xì)胞后存在體液免疫的缺陷，但目前SLE的治療策略同樣增加感染的風(fēng)險(xiǎn)，從CAR-T治療血液惡性腫瘤的經(jīng)驗(yàn)來看，CD19-CAR治療過的腫瘤患者，仍然可以重新生成具有分泌保護(hù)性抗體的B細(xì)胞。其次，CAR-T治療過程中可能出現(xiàn)的毒性及細(xì)胞因子風(fēng)暴均有相對應(yīng)的治療手段。

小結(jié):靶向耗竭B細(xì)胞的治療策略在自身免疫病中有一定療效。與選擇傳統(tǒng)的生物制劑相比，CAR-T技術(shù)在清除B細(xì)胞的深度、效能、持續(xù)性有著絕對的優(yōu)勢?；A(chǔ)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的不斷深入，為實(shí)施CAR-T治療SLE提供了理論基礎(chǔ)及技術(shù)支持。開展CAR-T治療SLE的臨床實(shí)驗(yàn)，將可能為難治性重癥SLE，乃至更多的自身免疫性疾病患者提供新的治療選擇，打開新的治療局面。