伴蛋白結(jié)合毒素升高尿毒癥模型的建立

張 冬 任宏偉 李 川 孔 凌 龔德華

血液透析(HD)是終末期腎病(ESRD)患者腎臟替代治療的主要方式之一,其發(fā)展離不開對尿毒癥毒素的不斷認(rèn)識和新型膜材料、吸附材料的推陳出新。近年來蛋白結(jié)合毒素(PBUTs),尤其是硫酸吲哚酚(IS)和硫酸對甲酚(PCS)，對慢性腎臟病(CKD)患者心血管并發(fā)癥的影響備受關(guān)注[1-3],其可能作用途徑為介導(dǎo)氧化應(yīng)激[4-7]，促進炎癥激活[7-9]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]等對腎臟和心血管系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害。由于其蛋白結(jié)合率高(>90%)[11]，難以被常規(guī)的HD包括彌散和對流方式清除，而吸附被認(rèn)為是可能的唯一有效清除手段。從小分子毒素到中分子毒素，對應(yīng)著低通量透析與高通量透析及血液透析濾過技術(shù)的發(fā)展，而PBUTs則需應(yīng)用吸附技術(shù)。新的HD材料及模式，在用于人體治療之前，都必須經(jīng)過體外實驗及動物實驗來驗證其效果及安全性，尿毒癥動物模型建立是動物實驗的前提?，F(xiàn)有文獻報道尿毒癥模型如缺血再灌注模型[12]，5/6腎切除模型[13]，腺嘌呤腎衰竭模型[14]等都是基于小動物模型，不適合HD治療，而大動物尿毒癥模型的缺乏，使得目前對新型HD材料的驗證，一般采用血制品進行體外循環(huán)實驗，極少數(shù)基于微型血液凈化平臺進行在體小動物模型HD實驗。建立能滿足HD治療的大動物尿毒癥模型很有必要。本研究通過關(guān)木通提取物造成豬尿毒癥狀態(tài)，并予吲哚酚和對甲酚灌胃，建立了伴PBUTs升高的大動物尿毒癥模型；觀察3個月內(nèi)腎功能指標(biāo)、PBUTs、β2微球蛋白、鈣磷代謝等相關(guān)參數(shù)的動態(tài)變化及組織形態(tài)學(xué)改變。

材料與方法

關(guān)木通提取物制備稱取關(guān)木通切片200g，加入95%乙醇溶液2 000 ml，浸泡1h，加熱至微沸，回流提取2h，過濾；濾渣中再加入95%乙醇溶液1 600 ml回流提取2h，過濾。合并兩次提取物，減壓濃縮至浸膏狀，4℃保存。采用高效液相色譜法測定關(guān)木通浸膏中馬兜鈴酸A含量為1.02%(10.2 mg/g)。

動物模型制備取9頭體重30～40 kg家豬(雌雄不限，由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供)，于實驗第1天、第3天給予關(guān)木通浸膏1.5 g/kg·d(相當(dāng)于15.3 mg/kg·d馬兜鈴酸A)灌胃；實驗第4d、8d、10d、12d，給予吲哚酚50 mg/kg(sigma，美國)+對甲酚100 mg/kg (sigma，美國)+20 ml 75%酒精灌胃。給藥期間，家豬自由飲食。另取2頭家豬處死以留取腎臟組織作正常腎臟病理。

觀察項目灌胃給藥期間(第1天～第13天)，每日從豬前腔靜脈采血，留取血液標(biāo)本;實驗第1天、第4天、第11天在超聲引導(dǎo)下進行膀胱穿刺留取尿液;實驗第15天、第20天、第25天、第30天、第45天、第60天、第75天、第90天留取血液標(biāo)本。實驗結(jié)束前(第90天)，存活豬在全麻狀態(tài)下，經(jīng)腹正中切口取出一側(cè)腎臟，留取部分組織作形態(tài)學(xué)觀察，并注射過量丙泊酚處死。

血液標(biāo)本中生化項目及血液常規(guī)項目由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗科檢測，β2微球蛋白按ELISA試劑盒(Elabscience，中國)說明書進行檢測。送檢蛋白結(jié)合毒素IS、PCS的血液標(biāo)本經(jīng)離心后取上層血清-80℃冰箱凍存，集中采用質(zhì)譜-高效液相色譜法檢測(濟南英盛生物公司)，尿檢標(biāo)本由國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心檢測。腎臟組織由10%福爾馬林固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片后行HE及Masson染色。

統(tǒng)計分析采用《SPSS 21.0》軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較采用配對樣本t檢驗。不符合非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，兩兩比較采用Wilcoxon符號秩檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

經(jīng)2次關(guān)木通提取物灌胃后，所有豬均出現(xiàn)不同程度活動減少、食欲降低及胃腸道反應(yīng)，1周內(nèi)體重下降達(dá)4～11 kg。在9頭實驗豬中，3頭(2、7、9號)出現(xiàn)少尿，水腫，嗜睡，均在3周內(nèi)死亡；其余6頭表現(xiàn)為尿量增多，除4號豬因手術(shù)臺上嘔出大量胃內(nèi)容物誤吸死于第5周外，其余5頭均在1個月左右食欲、精神好轉(zhuǎn)，并存活至3個月后實驗結(jié)束。

圖2 尿毒癥模型前后豬血清主癥毒素水平

尿液指標(biāo)實驗第4天，所有豬的尿蛋白和尿紅細(xì)胞計數(shù)均出現(xiàn)陽性，以輕～中度為主，同時伴不同程度的尿葡萄糖和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)升高；第11天大部分豬尿檢轉(zhuǎn)為陰性，尿葡萄糖和尿NAG仍保持輕～中度升高水平(圖1)。

血清主要尿毒癥毒素關(guān)木通提取物灌胃后，SCr和BUN進行性升高，在第8d～15d達(dá)高峰，實驗第15d,兩者分別達(dá)基礎(chǔ)水平的12.9倍(P<0.01)和9.9倍(P=0.011)；第20d后，血清肌酐(SCr)和血清肌酐(BUN)逐步下降；第45d后，SCr和BUN分別穩(wěn)定在基礎(chǔ)水平的6.2倍和5.1倍左右(P均<0.05)，直至實驗結(jié)束(圖2A、B)。

圖1 豬尿毒癥模型前后尿檢變化

IS和PCS在關(guān)木通提取物灌胃后明顯升高，實驗第4天，IS和PCS升至基礎(chǔ)水平6.5倍和2.2倍(P均<0.05); 經(jīng)4次對甲酚和吲哚灌胃后，實驗第15d,IS和PCS升至基礎(chǔ)水平的73.3倍 和8.9倍(P均<0.05);吲哚酚和對甲酚停止給藥后，IS和PCS水平逐漸下降;第45天后，IS和PCS分別穩(wěn)定在基礎(chǔ)水平的12.5倍和3.8倍左右(P均<0.05)直至實驗結(jié)束(圖2C、D)。血清β2微球蛋白在實驗期間無明顯變化(圖2E)。

其他指標(biāo)血鈣僅在實驗第90天較基礎(chǔ)水平輕度升高(P<0.05)；血磷在實驗期間未見明顯變化(P均>0.05)(圖3A、B)。同型半胱氨酸在實驗第15天升高不顯著(P>0.05)，第90天較基礎(chǔ)水平顯著升高(P<0.05)(圖3C)。血紅蛋白在實驗第15天較基礎(chǔ)水平顯著下降(P<0.05)，實驗第90天仍低于基礎(chǔ)水平，但差異不顯著(P>0.05)(圖3D)。

圖3 尿毒癥模型前后其他指標(biāo)的變化

組織形態(tài)學(xué)改變2、7、9號豬因夜間死亡未及時留取腎臟組織，死于實驗第31d的4號豬留取了腎臟組織，余5頭豬存活至3月時處死留取腎臟組織。HE染色: 實驗1個月廣泛可見大量腎小管擴張，伴有間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(4號豬)；3個月可見腎小球數(shù)量減少，球囊腔擴大，殘余腎小管高度擴張(1號豬)。Masson染色：1個月間質(zhì)中可見較多的膠原纖維增生(4號豬)；3個月可見大量膠原纖維增生(6號豬)(圖4)。

圖4 豬尿毒癥模型后腎臟組織病理變化

討 論

本文報道了通過關(guān)木通提取物灌胃建立的可長期存活的豬尿毒癥模型，其特點如下：早期(第1天～第20天)主要表現(xiàn)為腎功能的快速下降及SCr和BUN的急劇上升，一過性的血尿、蛋白尿和持續(xù)的腎小管損傷表現(xiàn)(如尿NAG和尿糖升高)，IS和PCS明顯升高，吲哚酚和對甲酚灌胃加速兩者累積；中期(第20天～第45天)主要表現(xiàn)為腎功能的部分恢復(fù)，SCr、BUN、IS和PCS水平達(dá)峰后下降；晚期(第45天～第90天)表現(xiàn)為相對穩(wěn)定腎衰竭期。本模型在大動物上再現(xiàn)了臨床馬兜鈴酸腎病及既往小動物馬兜鈴酸腎病模型的特點[15]，即急性期的腎小管損傷及遠(yuǎn)期的慢性化病變即尿毒癥狀態(tài)。建立本模型的主要目的是為今后尿毒癥毒素清除的血液凈化大型動物實驗打下基礎(chǔ)。

我們選擇馬兜鈴酸作為腎損傷藥物主要基于其直接損傷腎小管上皮細(xì)胞，使之變性、壞死或凋亡[16]，臨床則表現(xiàn)為腎小管重吸收障礙及非少尿性腎功能衰竭。造模動物長期存活的關(guān)鍵是保證水負(fù)荷調(diào)節(jié)能力存在，即尿量正常，而本實驗中3頭早期死亡的豬正是因為少尿、水腫所致。此外，這種腎小管功能損傷模型也有利于PBUTs的蓄積。既往研究證實，大劑量的馬兜鈴酸損傷近端腎小管上皮細(xì)胞，而PBUTs的排泄則依賴于基底膜側(cè)陰離子轉(zhuǎn)運蛋白的分泌作用[17]。因此，本實驗早期即出現(xiàn)IS和PCS的顯著升高。為進一步升高兩者血清水平，我們還采用了吲哚酚和對甲酚灌胃的方法，而體內(nèi)IS和PCS的生成也主要源于腸道菌群分解食物蛋白產(chǎn)生吲哚酚和對甲酚，并經(jīng)門脈系統(tǒng)入肝后再經(jīng)硫酸化形成IS和PCS[18]。在預(yù)實驗階段(結(jié)果未展示)，我們以吲哚酚和對甲酚在大鼠中的LD50為依據(jù)，在安全范圍內(nèi)對吲哚酚和對甲酚劑量進行多次調(diào)整，最終將兩者的灌胃劑量確定為50 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)，經(jīng)實驗證實，經(jīng)4次灌胃后，IS和PCS血清水平可達(dá)到甚至超出HD人群的平均水平。這種伴高水平PBUTs的大動物尿毒癥模型可為新型吸附材料的研發(fā)提供極大便利。既往新型吸附材料在研發(fā)階段主要通過體外動、靜態(tài)吸附的方式評估PBUTs的清除效果[19-22]。近年來，隨著電腦技術(shù)的發(fā)展，可模擬患者體內(nèi)蛋白、游離毒素及PBUTs三者動態(tài)平衡的動力學(xué)模型也可用于PBUTs的清除效果評估[23-24]。然而，在模擬人體血流動力學(xué)、毒素分布容積以及評估生物相容性等方面，體外實驗和數(shù)學(xué)模型均不及體內(nèi)實驗。截至目前，PBUTs在動物模型中的研究僅局限于部分小鼠或大鼠的腎衰竭模型。盡管研究顯示，缺血再灌注損傷[12]和5/6腎切除的小鼠腎衰竭模型中[10,13]可伴PBUTs明顯升高，但大型動物手術(shù)操作難度遠(yuǎn)比小動物復(fù)雜，且術(shù)后護理困難。而部分腎毒性藥物，如順鉑[25]，腺嘌呤[14]，雖可引起PBUTs升高，但價格昂貴，同樣不適用于大動物腎衰竭模型的建立。本研究報告的伴PBUTs升高的豬尿毒癥模型，不僅具有造模時間短，尿毒癥毒素水平高，存活時間長等優(yōu)點，而且操作簡單，成本低廉，可用于今后血液凈化域?qū)BUTs清除方面的研究。

需要注意的是，盡管本實驗馬兜鈴酸劑量參照小動物模型而來[14]，但大動物對馬兜鈴酸反應(yīng)的個體差異更為明顯。雖然本實驗中大部分豬存活3個月以上并穩(wěn)定表現(xiàn)為尿毒癥，但也有1/3豬腎損傷嚴(yán)重，表現(xiàn)為少尿型急性腎損傷，毒素升高速度及程度遠(yuǎn)高于非少尿型，導(dǎo)致其生存時間短于3周,且尿檢與臨床所見與馬兜鈴酸所致少尿型急性腎損傷相似。因此，為提高動物模型存活率，今后研究可嘗試適當(dāng)降低關(guān)木通提取物灌胃劑量。此外，本模型并未發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者常見的血磷升高，可能與腎小管吸收障礙后磷丟失增加有關(guān)，這也與臨床腎小管損傷患者常表現(xiàn)低磷血癥相一致。是否可在此模型基礎(chǔ)上通過高磷飲食喂飼的方式制造出尿毒癥高磷血癥模型還需今后進一步研究。同樣，本模型也未觀察到β2微球蛋白水平的升高，而小分子蛋白毒素清除也是血液凈化材料研發(fā)重點，因此今后還需進一步研究伴β2微球蛋白水平升高的大動物尿毒癥模型。

小結(jié)：通過關(guān)木通提取物灌胃方式可建立長期存活的豬尿毒癥模型，在此基礎(chǔ)上進行吲哚酚和對甲酚灌胃，可顯著升高PBUTs水平。這種簡便的大動物尿毒癥模型，可為今后血液凈化動物實驗提供最為接近人體治療的途徑，特別是針對PBUTs的清除研究。但此模型并未能表現(xiàn)出高磷血癥及高β2微球蛋白水平，提示仍需進一步研究建立具有此類特征的大動物尿毒癥模型的方法。