外周血宏基因組二代測(cè)序?qū)Ψ捂咦泳窝椎脑\斷價(jià)值

顧 鵬 許書(shū)添 姜 雪 周玉超 周 云 李 喆 李世軍

耶氏肺孢子菌(PJ)是一種機(jī)會(huì)感染性病原體,可引起致命性的肺孢子菌肺炎(PCP)。隨著免疫抑制劑、放化療的廣泛應(yīng)用,PCP在器官移植、自身免疫疾病、腫瘤等患者中呈現(xiàn)不斷增加趨勢(shì)[1]。腎臟移植與多種腎臟疾病的患者因長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑,可處于免疫抑制狀態(tài)[2]。在此類(lèi)患者PCP并不少見(jiàn),可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),常需要機(jī)械輔助通氣,病死率高[3]。及時(shí)診斷和啟動(dòng)PCP特異性治療是降低病死率的關(guān)鍵[4]。但PCP的早期病原學(xué)診斷困難,需要進(jìn)行肺泡灌洗,并在顯微鏡下檢出肺孢子菌或者聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 陽(yáng)性來(lái)確診,部分患者不能耐受肺泡灌洗等有創(chuàng)檢查,病原檢出率低[5],容易延誤診治。宏基因組二代測(cè)序(mNGS)技術(shù)已被廣泛用于多種感染性疾病的研究,在血液、腦脊液及呼吸道標(biāo)本中均表現(xiàn)出良好的診斷性能[6]。有研究發(fā)現(xiàn),mNGS在外周血中檢出PJ序列,并結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特征,可以確診PCP,但在臨床中僅有少數(shù)案例[7]。本研究將mNGS用于腎臟病免疫抑制患者合并PCP的外周血樣本的檢測(cè),旨在前瞻性探索外周血中mNGS對(duì)于PCP病原學(xué)的診斷價(jià)值。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象選取2018年8月至2019年12月,因腎移植或其他腎臟疾病接受免疫抑制治療,并發(fā)肺部感染入住國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心重癥監(jiān)護(hù)病房的患者。

入選標(biāo)準(zhǔn)(1)入選的患者為腎移植術(shù)后或其他腎臟疾病,有接受糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期治療(>30d)和或高劑量糖皮質(zhì)激素[>1 mg/(kg·d)],或其他免疫抑制藥物治療史(>30d);(2)臨床擬診為PCP,即具有以下表現(xiàn)者作為觀察組[4]:合并呼吸困難、進(jìn)行性缺氧等表現(xiàn);胸部高分辨率CT可見(jiàn)磨玻璃樣改變和(或)肺間質(zhì)彌漫浸潤(rùn)病變等典型改變。(3)另選取臨床確診為其他病原(細(xì)菌、真菌、病毒等)導(dǎo)致肺部感染的患者作為對(duì)照組。

相關(guān)定義ARDS指肺部急性病變導(dǎo)致的以低氧血癥為特征的臨床綜合征,即氧合指數(shù)(動(dòng)脈氧分壓/吸入氧濃度)≤300 mmHg、并且呼吸末正壓或持續(xù)氣道正壓≥5 cmH2O;根據(jù)氧合指數(shù)分為輕度(200～300 mmHg)、中度(100～200 mmHg)及重度(<10 mmHg)。真菌G聯(lián)合乳酸脫氫酶(BG/LDH)檢測(cè):由于獲得PCP病原學(xué)診斷極為困難,在缺乏PCP病原學(xué)診斷時(shí),臨床上常在肺部影像學(xué)呈雙肺磨玻璃影樣改變的患者中使用血清1,3-β-D葡聚糖(BG,真菌G)試驗(yàn)陽(yáng)性(>60 pg/ml)且乳酸脫氫酶(LDH)升高(>618 U/L)作為診斷PCP的標(biāo)準(zhǔn)[8-9];采用急性生理與慢性健康評(píng)分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ評(píng)分):評(píng)估患者的病情危重程度[10]。

mNGS檢測(cè)流程和方法(1)采集患者的血液樣本均符合mNGS檢測(cè)要求(使用K管采集的外周血樣本不少于3 ml、6～35℃儲(chǔ)存),使用BGISEQ-500/50平臺(tái)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果去除低質(zhì)量的和長(zhǎng)度小于35bp的數(shù)據(jù)以獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)。通過(guò)BWA(BWA:http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對(duì)將人源核酸序列的數(shù)據(jù)去除。剩余數(shù)據(jù)在去除低復(fù)雜度序列后與專(zhuān)用的微生物數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),測(cè)序后的數(shù)據(jù)按照病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)等進(jìn)行分類(lèi)和排列。(2)在采集mNGS血液樣本的同時(shí)送檢對(duì)應(yīng)的血培養(yǎng)、痰或肺泡灌洗液(BALF)病原(細(xì)菌、真菌)培養(yǎng)(時(shí)間差≤1天)。病原培養(yǎng)、胸部高分辨率CT和其他檢測(cè)均在國(guó)家腎臟病臨床醫(yī)學(xué)研究中心相關(guān)科室完成。

觀察資料(1)患者的基本信息:年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、免疫抑制方案、患者轉(zhuǎn)歸;(2)肺部感染相關(guān)指標(biāo):ARDS分級(jí)、肺部影像學(xué)表現(xiàn);(3)免疫指標(biāo):CD4+淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、真菌G試驗(yàn)、乳酸脫氫酶、降鈣素原、C反應(yīng)蛋白等;(4)mNGS病原檢測(cè):樣本類(lèi)型、采集時(shí)間、檢測(cè)結(jié)果、病原種類(lèi)及序列、細(xì)菌培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用《SPSS 22.0》軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料用“例數(shù)”和“率”表示;計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,含極端值的計(jì)量資料使用中位數(shù)表示;符合正態(tài)分布的組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的比較采用秩和檢驗(yàn);定性資料以頻數(shù)(%)表示,采用卡方檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

病例臨床特征 觀察組入選37例患者,男性20例,女性17例;平均年齡45.8歲(表1),原發(fā)病因包括11例腎移植受者、7例IgA腎病、7例膜性腎病，冷球蛋白血癥、足細(xì)胞病和局灶性節(jié)段硬化各2例,膜增生性腎小球腎炎、IgM腎病、單克隆免疫球蛋白病、ANCA相關(guān)性腎炎、過(guò)敏性紫癜性腎炎和狼瘡性腎炎各1例;對(duì)照組入選25例其他病原(19例細(xì)菌、3例曲霉、3例病毒)引起肺部感染的患者,包括8例腎移植受者,5例狼瘡性腎炎,膜性腎病和冷球蛋白血癥各2例,足細(xì)胞病、微小病變、系統(tǒng)性淀粉樣變性、POEMS綜合征和抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(ANCA)相關(guān)性腎炎各1例,3例未行活檢。

表1 入組患者的基本情況

ARDS：急性呼吸窘迫綜合征；APACHE Ⅱ：急性生理與慢性健康評(píng)分

mNGS檢測(cè)觀察組37例患者,送檢了37份外周血樣本。其中35份檢出了PJ序列(陽(yáng)性),同時(shí)檢出了其他病原序列(表2、圖1)。2例(樣本8、21)未檢出PJ序列(陰性)的,其中1例1周后重復(fù)送檢結(jié)果陽(yáng)性。對(duì)照組送檢25份外周血樣本,PJ序列均為陰性。

表2 入組病原檢出結(jié)果

mNGS：宏基因組二代測(cè)序技術(shù)；Culture：病原培養(yǎng)；Type：標(biāo)本類(lèi)型；BALF：肺泡灌洗液；HSV:人類(lèi)皰疹病毒1型;VZV:人類(lèi)胞皰病毒3型;EBV:人類(lèi)皰疹病毒4型;CMV:人類(lèi)皰疹病毒5型

圖1 觀察組mNGS檢測(cè)結(jié)果

BG/LDH檢測(cè)在觀察組中,有33例患者真菌G試驗(yàn)陽(yáng)性且LDH升高,另4例患者多次檢測(cè)真菌G試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。而在對(duì)照組中,有11例真菌G試驗(yàn)陽(yáng)性且LDH升高,真菌G試驗(yàn)陽(yáng)性的原因考慮合并其他真菌感染或假陽(yáng)性。

檢測(cè)效能mNGS檢測(cè)在外周血中診斷PCP的敏感度94.59%,特異度100%;真菌G聯(lián)合LDH檢測(cè)的敏感度89.19%,特異度56.0%。在外周血中使用mNGS診斷PCP,其特異度較缺乏病原學(xué)、僅通過(guò)真菌G試驗(yàn)陽(yáng)性聯(lián)合LDH升高診斷PCP有顯著優(yōu)勢(shì)(表3)。

表3 兩種方法結(jié)果比較

mNGS：宏基因組二代測(cè)序技術(shù)；BG/LDH：真菌G聯(lián)合乳酸脫氫酶檢測(cè)

其他病原檢測(cè)結(jié)果觀察組37例患者中,有31例使用mNGS檢出了合并感染的其他病原序列。合并病毒感染27例,其中19例(51.4%)檢出了巨細(xì)胞病毒(CMV,人類(lèi)皰疹病毒5型),6例檢出了EB病毒(EBV,人類(lèi)皰疹病毒4型),5例檢出了單純皰疹病毒(HSV,人類(lèi)皰疹病毒1型),7例檢出了細(xì)環(huán)病毒屬。有8例合并細(xì)菌感染,其中葡萄球菌屬2例,不動(dòng)桿菌2例,肺炎克雷伯菌1例,大腸埃希菌1例,其他不常見(jiàn)菌屬4例。病原(細(xì)菌、真菌)培養(yǎng)結(jié)果:觀察組所有血培養(yǎng)結(jié)果均為陰性(培養(yǎng)5天均無(wú)菌生長(zhǎng)),2例鮑曼不動(dòng)復(fù)合桿菌(1例痰、1例BALF),1例陰溝腸桿菌(BALF),1例肺炎克雷伯菌(痰),1例產(chǎn)吲哚黃桿菌(痰),1例白色念珠菌(痰),1例銅綠假單胞菌(痰)。NGS和細(xì)菌培養(yǎng)檢出的病原種類(lèi)見(jiàn)表2、圖1。

治療與預(yù)后觀察組中所有患者均給予復(fù)方磺胺甲噁唑片聯(lián)合棘白菌素抗PJ治療,以及廣譜抗生素防治細(xì)菌感染,有1例患者因合并曲霉感染給予抗曲霉治療,有4例患者針對(duì)巨細(xì)胞病毒給予抗病毒治療。31例患者在病程中合并ARDS,其中11例需要機(jī)械輔助通氣治療。經(jīng)治療后,有29例病情好轉(zhuǎn),8例死亡。對(duì)照組患者給予廣譜抗生素防治細(xì)菌感染,有3例給予抗曲霉治療,有3例給予抗病毒治療。9例患者合并ARDS,5例接受機(jī)械輔助通氣治療。最終有20例病情好轉(zhuǎn),5例死亡。

討 論

PCP的傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法通過(guò)采集患者的呼吸道標(biāo)本(痰液、肺泡灌洗液),染色后在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)PJ的包囊或滋養(yǎng)體為確診依據(jù),這種診斷技術(shù)受到染色方法、標(biāo)本采集、病原載量等多種因素影響,其準(zhǔn)確性、檢出率低。PCR技術(shù)通過(guò)檢測(cè)呼吸道標(biāo)本中PJ的DNA序列來(lái)確診PCP,在痰標(biāo)本中檢出率低,本研究中有5例患者病程中送檢痰標(biāo)本PCR檢測(cè)均為陰性(結(jié)果未發(fā)表),在肺泡灌洗液中有較高的敏感度(91.3%～99.7%)和特異度(82.7%～95.5%),但需要支氣管肺泡灌洗術(shù),部分重癥患者難以耐受[11]。也有研究使用mNGS檢測(cè)PCP患者的呼吸道標(biāo)本,顯示出較好的檢測(cè)效能[6]。由于耶氏肺孢子菌在人類(lèi)Ⅰ型肺泡細(xì)胞表面定植和生長(zhǎng),非HIV的免疫缺陷患者中定植率較高(17.14%)[12],使用PCR或者其他基因檢測(cè)等方法對(duì)呼吸道標(biāo)本的檢測(cè),難以確定合適的閾值來(lái)區(qū)分感染或定植[13]。

本研究通過(guò)mNGS檢測(cè)PCP患者外周血中的病原序列,證實(shí)了這種方法用于PCP的診斷,具有較高的敏感度(94.59%)和特異度(100%),送檢樣本后72h內(nèi)即可得出檢驗(yàn)結(jié)果。不但具有無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn),而且避免了PJ在呼吸道定植的干擾,相對(duì)于肺泡灌洗、肺組織活檢等有創(chuàng)檢查方法極具優(yōu)勢(shì)。血中檢出PJ序列的原因,有研究認(rèn)為是由于患者免疫系統(tǒng)受損時(shí),PJ能夠穿透局部的感染部位進(jìn)入外周血導(dǎo)致[6]。觀察組中2例樣本結(jié)果陰性的原因:2例患者前期病情較輕,可能肺孢子菌尚未進(jìn)入外周血。其中1例患者1周后復(fù)查結(jié)果陽(yáng)性。mNGS結(jié)果中檢出序列數(shù)(reads)是指匹配到該病原的序列數(shù)目,其多少與標(biāo)本中病原體本身載量負(fù)荷、核酸提取量、人源序列比例有關(guān),數(shù)值越高,表示檢測(cè)到該病原體的可信度越高[14],PJ序列數(shù)僅對(duì)PCP的診斷有意義,與PCP的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后尚無(wú)明顯相關(guān)。

在缺乏PCP的病原學(xué)診斷時(shí),臨床醫(yī)師常通過(guò)PCP特征性的肺部表現(xiàn)、真菌G試驗(yàn)陽(yáng)性聯(lián)合乳酸脫氫酶升高作為診斷依據(jù)。PCP特征性肺部改變是以?xún)煞伍g質(zhì)性和肺泡性病變?yōu)榛A(chǔ),依病情進(jìn)展表現(xiàn)出磨砂玻璃型、斑片型、間質(zhì)型、囊變型四種類(lèi)型,臨床上較難與巨細(xì)胞病毒或其他肺間質(zhì)疾病鑒別[15]。真菌G試驗(yàn)可因合并其他真菌感染出現(xiàn)陽(yáng)性,部分重癥患者需要血液透析治療、或使用白蛋白、免疫球蛋白等藥物而出現(xiàn)假陽(yáng)性。一些研究認(rèn)為真菌G試驗(yàn)陰性可以排除PCP[16],但在本研究中,有4例臨床診斷PCP的患者病程中多次檢測(cè)真菌G試驗(yàn)均為陰性,其他研究也有類(lèi)似情況[6]。此外,乳酸脫氫酶廣泛存在于人體各組織中,肺部感染和多種肺外疾病中都能引起LDH升高,特異性較差。對(duì)照組中12例患者起病初期有類(lèi)似PCP的肺部影像學(xué)表現(xiàn)。有11例患者真菌G試驗(yàn)陽(yáng)性伴L(zhǎng)DH不同程度的升高,本研究中使用真菌G聯(lián)合LDH診斷PCP的方法特異性欠佳(56%),因此,在缺乏病原學(xué)診斷時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)非PCP患者使用抗PJ治療,增加了潛在藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

mNGS檢測(cè)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以在鎖定某種病原體同時(shí)檢測(cè)混合感染。本研究中mNGS在檢出PJ序列的同時(shí),也顯示了合并其他感染的病原序列,特別對(duì)病毒顯示出較高的陽(yáng)性率,37例患者中有27例(73%)檢出了不同的病毒序列,其中以CMV最為突出。有研究指出,合并CMV、HSV是非HIV感染的PCP患者預(yù)后不良因素之一,也是其免疫抑制狀態(tài)的間接標(biāo)志[17]。本研究中合并CMV的19例患者最終有6例(31.6%)死亡,其中1例同時(shí)合并HSV及EBV。在未合并CMV的18例患者中,有2例死亡。對(duì)于PCP合并CMV的患者,可能需要同時(shí)聯(lián)合抗病毒治療。

淋巴T細(xì)胞減少和功能低下是PCP患者的特征之一,指南中把CD4+淋巴T細(xì)胞計(jì)數(shù)<200個(gè)/μl作為PCP感染高風(fēng)險(xiǎn)的因素,同時(shí)作為啟動(dòng)初級(jí)預(yù)防治療的指征,并將 CD4+淋巴細(xì)胞恢復(fù)超過(guò)200個(gè)/μl作為可以停止預(yù)防治療的參考標(biāo)準(zhǔn)之一[18]。本研究發(fā)現(xiàn),在臨床診斷PCP患者(觀察組)中,有12例患者CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)超過(guò)200個(gè)/μl,甚至其中4例>400個(gè)/μl,此類(lèi)患者的病情較輕,預(yù)后好。因此,臨床上對(duì)于符合PCP臨床表現(xiàn)的接受免疫抑制治療的腎臟病患者,即使CD4+計(jì)數(shù)較高,也需要排除PCP。

本研究是目前樣本量最大的,將mNGS用于腎臟病免疫抑制患者合并PCP的單中心研究。發(fā)現(xiàn)了mNGS在外周血中檢出PJ序列可以作為PCP的病原學(xué)診斷依據(jù),提高了PCP的早期診斷率,為臨床醫(yī)師在疑似PCP患者中使用抗PJ治療提供了病原學(xué)依據(jù),也避免了不合理用藥。同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn)PCP還可能合并其他病原體感染(特別是CMV),為臨床醫(yī)師及時(shí)采取相應(yīng)的治療措施提供了方向,改善患者的預(yù)后。同時(shí)本研究提出CD4>200個(gè)/μl不能作為接受免疫抑制治療的腎病患者排除PCP的指標(biāo)。本研究尚存在以下不足,缺乏呼吸道標(biāo)本染色鏡檢或PCR等其他PCP病原學(xué)診斷方法,對(duì)檢出合并感染的病毒序列,缺乏特異性血清抗體等方檢測(cè)法作為對(duì)照。

小結(jié):mNGS作為新興的病原學(xué)基因檢測(cè)診斷技術(shù),用于診斷PCP不但具有準(zhǔn)確快速的特點(diǎn),避免呼吸道定植的干擾,還可以檢出合并的混合其他病毒或細(xì)菌感染,較PCP的其他病原學(xué)診斷方法更具優(yōu)勢(shì)。對(duì)免疫抑制合并肺部感染患者的診斷有重要的指導(dǎo)意義。