好氧遷移外源有機(jī)物轉(zhuǎn)變成內(nèi)源聚合物驅(qū)動(dòng)內(nèi)源反硝化

崔有為， 金常林

(北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院， 北京 100124)

生活污水脫氮能夠有效解決水體富營(yíng)養(yǎng)化，但是生活污水普遍存在碳氮比(ρ(C)/ρ(N))低、碳源不足導(dǎo)致的反硝化不充分的問題. 污水處理廠普遍通過采用投加外源碳源提高反硝化脫氮能力[1]. 現(xiàn)有的脫氮處理工藝使污水原水中的碳源在好氧條件下被氧化浪費(fèi)，產(chǎn)生CO2溫室氣體，同時(shí)在反硝化階段投加碳源增加了污水廠處理成本. 如何高效利用污水中的有機(jī)物用于脫氮是污水處理技術(shù)革新的目標(biāo). 如果能夠避免原水中的有機(jī)物在好氧環(huán)境下被氧化消耗，而是遷移有機(jī)物到缺氧段作為反硝化碳源，將是高效利用原污水碳源、節(jié)約處理費(fèi)用的有效途徑[2]. 作為能源和碳源被微生物內(nèi)源儲(chǔ)存的物質(zhì)有聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)和糖原(Glycogen，Gly). PHA積累菌是在非穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)條件下儲(chǔ)存碳源的一類微生物. 馴化微生物內(nèi)源儲(chǔ)存采用盛宴饑餓機(jī)制(feast/famine，F(xiàn)/F)運(yùn)行模式[3-4]，即在好氧條件下充足碳源(盛宴)和缺乏碳源(饑餓)階段交替運(yùn)行，而且給予長(zhǎng)期的饑餓期(即較低F/F). 這樣，活性污泥在碳源非穩(wěn)態(tài)供應(yīng)下適應(yīng)了內(nèi)源優(yōu)先儲(chǔ)存的生長(zhǎng)模式，激發(fā)了內(nèi)源儲(chǔ)存能力. F/F非穩(wěn)態(tài)運(yùn)行模式是一種高效的積累PHA的馴化方式，目前發(fā)現(xiàn)的具有PHA積累能力的微生物達(dá)300多種[5]. 除了PHA積累菌外，聚磷菌(phosphate accumulating organisms，PAOs)也可以積累PHA. PAOs在厭氧條件下將細(xì)胞中的聚磷水解為正磷酸鹽釋放胞外并獲取能量，利用聚磷水解釋放的能量吸收污水中揮發(fā)性脂肪酸合成貯能物質(zhì)PHA[6-8]. 在好氧條件下，PAOs以氧為電子受體氧化胞內(nèi)貯存的PHA，利用該反應(yīng)產(chǎn)生的能量過量地從污水中攝取磷酸鹽，將聚磷作為貯存物貯于胞內(nèi). 強(qiáng)化生物除磷(enhanced biological phosphorus removal，EBPR)工藝中還存在一類與PAOs競(jìng)爭(zhēng)的聚糖菌(glycogen accumulating organisms，GAOs). GAOs在厭氧條件下降解積累的Gly，吸收外碳源合成PHA；在好氧條件下消耗PHA用于合成Gly. 因此，在好氧條件下能夠內(nèi)源儲(chǔ)存碳源的主要微生物是PHA積累菌和GAOs.

關(guān)于PHA積累菌在全程好氧條件下合成和利用PHA的研究被廣泛地報(bào)道. 最近的研究發(fā)現(xiàn)PHA積累菌除了利用分子態(tài)氧氧化儲(chǔ)存的PHA產(chǎn)生能量外，還可以在缺氧條件下利用化合態(tài)氧氧化PHA產(chǎn)生能量. 這為實(shí)現(xiàn)好氧內(nèi)源儲(chǔ)存碳源，缺氧反硝化硝酸鹽提供了理論基礎(chǔ)[9-11]. 因此，本研究采用好氧/缺氧(aerobic/anoxic，O/A)工藝模式運(yùn)行，探索水中碳源的好氧遷移用于缺氧反硝化的可行性. 研究重點(diǎn)考察內(nèi)源物質(zhì)儲(chǔ)存和脫氮效率、內(nèi)源反硝化計(jì)量，以及菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化等關(guān)鍵問題. 雖然PHA積累菌和GAOs的生物學(xué)機(jī)制得到廣泛研究，但是好氧條件下利用這些能夠儲(chǔ)存碳源的微生物遷移外源有機(jī)物在缺氧條件下內(nèi)源反硝的研究還未見報(bào)道，這種碳源遷移的模式可以降低污泥和CO2的產(chǎn)量，同時(shí)實(shí)現(xiàn)污水中有機(jī)物的原位利用[12].

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 污水和接種污泥

實(shí)驗(yàn)原水采用北京工業(yè)大學(xué)家屬樓化糞池處理出水. 生活污水的水質(zhì)指標(biāo)如表1所示. 活性污泥取自北京某污水處理廠. 該活性污泥具有較好的有機(jī)物去除、硝化、脫氮性能. 實(shí)驗(yàn)反應(yīng)器接種初始污泥質(zhì)量濃度在3 000 mg/L左右.

表1 生活污水水質(zhì)條件

1.2 反應(yīng)器的運(yùn)行

試驗(yàn)采用序批式反應(yīng)器(sequencing batch reactor，SBR)(見圖1)，有效體積為8 L，底面內(nèi)直徑為18.8 cm，高為40 cm. 生活污水化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand，COD)質(zhì)量濃度較低且波動(dòng)較大，為了更好地實(shí)現(xiàn)與觀察內(nèi)源積累和反硝化過程，采用投加葡萄糖提高進(jìn)水COD. 運(yùn)行第1—40天，投加葡萄糖使進(jìn)水COD質(zhì)量濃度在300 mg/L左右，曝氣量60 L/h. 為更明顯觀察遷移外碳源實(shí)現(xiàn)內(nèi)源積累和內(nèi)源反硝化脫氮效果，第41—180天增加葡萄糖投加量使進(jìn)水COD質(zhì)量濃度在500 mg/L左右，同時(shí)提高曝氣量至120 L/h. SBR的啟動(dòng)采用O/A模式運(yùn)行(見圖1(b)). 每個(gè)周期按照進(jìn)水、曝氣、攪拌、沉淀、排水和閑置順序進(jìn)行. 沉淀結(jié)束排水1/2. O/A時(shí)長(zhǎng)比為0.11，污泥齡(sludge retention time，SRT)為20 d，溫度為(28±2) ℃. 第1—65天，系統(tǒng)存在部分硝化，好氧曝氣1 h后進(jìn)行缺氧攪拌；第66—180天，硝化消失，以溶解氧(dissolved oxygen，DO)躍升作為好氧盛宴結(jié)束的信號(hào)，此時(shí)停止曝氣，內(nèi)源積累達(dá)到最大值. 好氧盛宴曝氣結(jié)束后投加0.293 g/L KNO3進(jìn)行缺氧攪拌，好氧盛宴積累的內(nèi)源聚合物有效用于反硝化脫氮過程，此時(shí)認(rèn)為內(nèi)源積累和內(nèi)源反硝化脫氮啟動(dòng)成功.

1.3 內(nèi)源反硝化計(jì)量實(shí)驗(yàn)

1.4 分析方法

1.5 微生物群體分析

為了測(cè)量微生物種群多樣性和菌群結(jié)構(gòu)的改變，采集接種原泥和馴化120 d的馴化污泥進(jìn)行分子生物學(xué)分析，污泥樣品在-20 ℃保存. 分析方法依據(jù)文獻(xiàn)[14,16]，使用E.Z.N.A.?固體DNA試劑盒(Omega Bi-TEK，Norcross，GA，美國(guó))從樣品中提取微生物DNA. 隨后采用擴(kuò)增細(xì)菌16S核糖體RNA基因的V4～V5區(qū)且?guī)l形碼的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增. 每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行樣，將對(duì)應(yīng)的3個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混勻?yàn)?個(gè)樣本；膠回收陽性克隆條帶用Tris 鹽酸進(jìn)行洗脫，根據(jù)2.0%瓊脂糖電泳對(duì)各陽性膠回收產(chǎn)物的初步定量結(jié)果，采用藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(QuantiFluorTM-ST, Promega, 美國(guó))定量檢測(cè)待測(cè)樣PCR產(chǎn)物后，將各待測(cè)樣的PCR產(chǎn)物根據(jù)測(cè)序量要求進(jìn)行混合. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案，在Illumina MiSeq平臺(tái)上將純化擴(kuò)增子整合測(cè)序. 序列被保存到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，存檔序列為SRP2905300.

1.6 計(jì)算

污泥中的PHA碳濃度計(jì)算公式為

c(PHA)=ρ(PHA)×0.046 5

(1)

污泥中的Gly碳濃度計(jì)算公式為

c(Gly)=ρ(Gly)×0.033 3

(2)

周期內(nèi)好氧盛宴期內(nèi)源聚合物(PHA+Gly)總產(chǎn)率計(jì)算公式為

(3)

式中：Δ(PHA+Gly)為周期內(nèi)好氧盛宴期積累的內(nèi)源聚合物濃度；ΔS為周期內(nèi)好氧盛宴期降解的外源有機(jī)物濃度.

比反硝化速率(specific denitrification rate，SDNR)計(jì)算公式為

(4)

微生物細(xì)胞聚合物與反硝化脫氮間的ρ(C)/ρ(N)計(jì)算公式為

(5)

好氧盛宴期胞內(nèi)聚合物的比生成速率(qP)、缺氧反硝化期間的胞內(nèi)聚合物的比降解速率(rP)和有機(jī)物的比攝取速率(qS)計(jì)算公式分別為

(6)

(7)

VSS、PHA以及Gly的分子式分別是CH1.8O0.5N0.2[3]、CH1.5O0.5[17]和CH2O(Gly檢測(cè)實(shí)際以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線).VSS、PHA和Gly的摩爾質(zhì)量分別是24.6、21.5、30.0 mg/mmol.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)性能

表2對(duì)比前期污泥和馴化穩(wěn)定后的特性. 接種污泥前期PHA和Gly碳濃度很低，分別為0.17 mmol/L和0.85 mmol/L，內(nèi)源產(chǎn)率僅為0.13±0.04. 經(jīng)過長(zhǎng)期馴化，污泥內(nèi)PHA和Gly濃度得到顯著增加，積累量分別平均為2.38 mmol/L和5.63 mmol/L，內(nèi)源產(chǎn)率YP/S提高為0.56±0.09. 值得注意的是，內(nèi)源積累物中Gly濃度得到了明顯增加，最大Gly濃度由初期污泥的(8.53±0.87) mmol/L增加至(24.86±1.21) mmol/L. Gly積累量占總內(nèi)源積累量的70.28%，成為主要的內(nèi)源積累物質(zhì). 有研究發(fā)現(xiàn)在好氧F/F條件以葡萄糖為碳源下會(huì)導(dǎo)致Gly的積累[18]，這可能也是本研究高Gly積累的主要原因. 對(duì)比馴化前后期，污泥合成的PHA中PHB和PHV質(zhì)量分?jǐn)?shù)沒有發(fā)生顯著變化，PHB質(zhì)量占PHA總質(zhì)量的80%左右.

表2 PHA和Gly在系統(tǒng)運(yùn)行初期和穩(wěn)定期的濃度和內(nèi)源聚合物平均總產(chǎn)率YP/S

注：進(jìn)水、好氧結(jié)束、出水分別代表每周期此時(shí)的系統(tǒng)污泥中聚合物濃度，平均總產(chǎn)率為好氧盛宴結(jié)束后內(nèi)源聚合物PHA和Gly的產(chǎn)率之和，括號(hào)內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)偏差.

2.2 周期分析

2.3 內(nèi)源反硝化計(jì)量

2.4 微生物種群變化

對(duì)接種原泥和馴化污泥進(jìn)行16S rRNA MiSeq 焦磷酸測(cè)序分析，定性種群結(jié)構(gòu)的變化(見圖6). 門水平分析微生物菌群豐度(>1%)的變化(見圖6(a)). 菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著差異性變化，原泥優(yōu)勢(shì)菌門Proteobacteria由原來的45.45%降低為次級(jí)菌門，豐度為28.99%. TM7成為富集菌群的優(yōu)勢(shì)菌群，豐度為36.78%. Bacteroidetes豐度由原來的28.26%降低為16.40%. 此外，Chloroflexi、Chlorobi和Acidobacteria菌群豐度均呈現(xiàn)不同程度的降低，相反，Actinobacteria、OD1、GN02菌群豐度略微增加. Others由原來的6.88%降低為3.80%. 從綱水平看(見圖6(b))，經(jīng)過馴化Betaproteobacteria由系統(tǒng)最優(yōu)勢(shì)綱變?yōu)榇尉V，比例由31.22%降為18.05%. TM7- 3成為優(yōu)勢(shì)綱，由0升高到36.87%. Lgnavibacteria (1.93%～1.29%)、Deltaprotebacteria(5.48%～2.23%)、Gammaproteobacteria(4.94%～3.20%)、Anaerolineae(8.04%～2.83%)、Bacteroidia(8.15%～5.93%)、Sapeospirae (12.07%～6.13%)、Acidmicrobiia(3.54%～<1.00%)、Flavobacteriia(3.94%～<1.00%)、Sphingobacteriia(3.83%～<1.00%)豐度降低；Actinobacteria(<1.00% ～5.02%)、unclassified Bacteroidetes(<1.00%～3.75%)和Alphaproteobacteria(3.77%～4.67%)等菌綱豐度增加， Others由11.33%降低為7.18%.

在F/F非穩(wěn)態(tài)條件、O/A工藝模式下，系統(tǒng)活性污泥微生物經(jīng)過長(zhǎng)期馴化菌群結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生了顯著變化. 馴化條件促進(jìn)了TM7菌門微生物的生長(zhǎng)，但是TM7菌群未曾報(bào)道具有內(nèi)源積累和反硝化功能[24]. TM7菌門的增加相對(duì)降低了原泥中的優(yōu)勢(shì)菌門Proteobacteria和Bacteroidetes的豐度. Proteobacteria是污水處理廠常見的一種優(yōu)勢(shì)菌門微生物[25]. Proteobacteria和Bacteroidetes菌門部分微生物曾被報(bào)道具有內(nèi)源積累和內(nèi)源反硝化的功能[26-27]. Chloroflexi具有吸收外碳源的功能[28-29]. Bacteroidetes菌門下的unclassified Bacteroidetes和Proteobacteria菌門下的Alphaproteobacteria被富集并可能負(fù)責(zé)PHA的積累[26,30]. 此外，Proteobacteria菌門下的Dechloromonas曾同時(shí)被報(bào)道具有除磷功能[31-32].

3 結(jié)論

1) 在F/F為0.11的非穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵條件下，O/A工藝模式可以實(shí)現(xiàn)混合菌群高效率積累內(nèi)源聚合物PHA和Gly驅(qū)動(dòng)內(nèi)源反硝化脫氮.

2) Gly是F/F非穩(wěn)態(tài)條件、O/A工藝模式下微生物積累的主要內(nèi)碳源，并主導(dǎo)了內(nèi)源反硝化脫氮效果.

3) 在F/F非穩(wěn)態(tài)條件下，O/A工藝模式改變了污泥的種群結(jié)構(gòu)和豐度，TM7為系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌門，unclassified Bacteroidetes和Alphaproteobacteria可能貢獻(xiàn)了PHA的積累.