參麥注射液對病毒性心肌炎病人外周血自噬及凋亡相關蛋白表達的影響

梁伯平，彭旭光，陳 蘭

病毒性心肌炎是由病毒感染引起的局部或彌漫性炎性病變，屬于感染性心肌疾病。在病毒流行期，約5%的病人患有心肌炎，并且這種疾病的發(fā)作較為分散。多種病毒感染可導致病毒性心肌炎的發(fā)生，尤其是柯薩奇病毒B3(CVB3)[1]。目前，病毒性心肌炎的發(fā)病機制尚不清楚，可能的發(fā)病機制包括直接病原體損傷和自體抗原/抗體誘導的免疫反應[2]。研究顯示，自噬在病毒性心肌炎的致病過程中有重要作用[3]。自噬是宿主應激反應的一部分，通過清除受損細胞質成分，發(fā)揮調節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)的作用[4]。但在病毒性心肌炎的發(fā)病機制中，CVB3可利用自噬逃避降解，促進病毒的復制和釋放，同時過度激活的自噬還可促進炎癥級聯(lián)反應，并加劇心肌炎的進展[5]。傳統(tǒng)中醫(yī)認為病毒性心肌炎的治療在于補心益氣、滋心養(yǎng)陰。研究顯示，以參麥注射液為代表的純中藥制劑，可有效提高病毒性心肌炎病人的臨床療效[6]，但具體機制尚不清楚。故本研究旨在探討參麥注射液對病毒性心肌炎病人外周血自噬及凋亡相關蛋白表達的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月—2020年7月在重慶市黔江中心醫(yī)院心血管內科住院的病毒性心肌炎病人152例作為研究對象，其中，男78例，女74例，年齡33～72(53.5±9.8)歲。按照隨機數字表法將病人分為觀察組和對照組，每組76例。納入標準：均符合《病毒性心肌炎診斷與治療指南》[7]；知情同意并簽署知情同意書者。排除標準：合并惡性腫瘤者；合并自身免疫性疾病、嚴重感染者；合并急性心肌梗死及感染性心內膜炎者；入院24 h內死亡者；對參麥注射液過敏者；治療依從性較差者。兩組病人性別、年齡、病程、紐約心臟協(xié)會(NYHA)心功能分級、基礎疾病等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 兩組病人基線資料比較

1.2 治療方法 對照組入院當日即給予休息、吸氧、抗病毒、營養(yǎng)心肌、極化液穩(wěn)定心電活動等對癥治療。觀察組在對照組基礎上加用參麥注射液(國藥準字Z51020552，雅安華潤三九藥業(yè)公司)40 mL+5%葡萄糖注射液250 mL靜脈輸注，每日1次。兩組在院治療療程均為2周，治療期間禁煙、禁酒、禁食辛辣及油膩食物。

1.3 觀察指標

1.3.1 自噬[人卷曲螺旋肌球蛋白樣Bcl-2結合蛋白(Beclin-1)、微管相關蛋白輕鏈3(LC3-Ⅱ)]及凋亡[半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)]相關基因mRNA水平檢測 采集病人治療前及治療后2周外周血3 mL，提取單核細胞后，采用TRIzol試劑(Takara公司)提取總RNA，進行逆轉錄，逆轉錄方法按試劑盒(Takara公司)說明進行，自噬相關基因(Beclin-1、LC3-Ⅱ)和凋亡相關基因(Caspase-3、Bcl-2)qPCR引物由上海生工公司合成。建立20 μL反應體系，反應條件：預變性，95 ℃、120 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)；溶解曲線：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、30 s，60 ℃、15 s。以GAPDH為內參，使用2-ΔΔCt方法計算相對mRNA水平。

1.3.2 自噬相關蛋白(Beclin-1、LC3-Ⅱ)表達水平檢測 提取病人治療前及治療后2周單核細胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。電泳分離，每孔加入50 μg蛋白電泳完成后轉移置硝基纖維素膜。采用牛血清白蛋白封閉，與稀釋的一抗進行孵育，抗Beclin-1抗體(1∶300)、抗LC3抗體(1∶400)及抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(1∶800)。次日孵育辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000)。以GAPDH為內參，計算目的條帶與GAPDH灰度比值。

1.3.3 心功能檢測 采用超聲心動圖檢測各組病人治療前后左室射血分數(LVEF)、左室舒張末期內徑(LVEDD)及左室收縮末期內徑(LVESD)。

1.3.4 外周血炎性指標檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法測定兩組病人治療前后外周血白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平，具體方法參照試劑盒說明書(武漢博士德生物公司)。

2 結 果

2.1 兩組自噬相關基因mRNA和蛋白表達水平比較 治療前，兩組病人外周血單核細胞中自噬相關基因Beclin-1、LC3-Ⅱ mRNA及蛋白表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，兩組病人自噬相關基因Beclin-1、LC3-Ⅱ mRNA及蛋白表達均較治療前明顯降低，其中觀察組較對照組降低更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2、圖1。

表2 兩組治療前后自噬相關基因mRNA水平比較(±s)

與治療前比較，＊P<0.05；與對照組治療后比較，# P<0.05。

2.2 兩組凋亡相關基因 mRNA表達水平比較 治療前，兩組病人外周血單核細胞凋亡相關基因Caspase-3和Bcl-2 mRNA水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，兩組病人Caspase-3 mRNA水平較治療前明顯降低，而Bcl-2 mRNA較治療前明顯升高，且觀察組治療后Caspase-3 mRNA水平較對照組降低更明顯，而Bcl-2較對照組升高更明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組凋亡相關基因mRNA水平比較(±s)

2.3 兩組血清炎性指標水平比較 治療前，兩組病人血清IL-6、TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后，兩組血清IL-6、TNF-α水平均較治療前明顯降低，其中觀察組較對照組降低更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 兩組血清IL-6、TNF-α水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.4 兩組心功能指標比較 治療前，兩組LVEF、LVEDD、LVESD比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

治療后，兩組LVEF、LVEDD、LVESD均較治療前明顯改善，且觀察組改善程度明顯優(yōu)于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表5。

表5 兩組LVEF、LVEDD、LVESD比較(±s)

2.5 兩組不良反應比較 治療期間，觀察組發(fā)生頭痛1例，惡心嘔吐2例，皮疹1例，對照組發(fā)生惡性嘔吐1例，頭痛2例；觀察組不良反應發(fā)生率為5.3%，對照組為3.9%，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組不良反應均較輕微，未經特殊處理癥狀均自行消失。

3 討 論

病毒性心肌炎是一種由病毒感染引起的以心臟炎性細胞浸潤為特征的心臟疾病，部分病人預后不良，可能會發(fā)展為擴張型心肌病和充血性心力衰竭。CVB3是引起病毒性心肌炎最常見的病毒亞型[1]，但其發(fā)病機制尚不明確，嚴重制約了該疾病的防治。中醫(yī)認為，病毒性心肌炎屬胸痹、怔忡，發(fā)病源于氣陰兩虛、熱毒傷心，治療上強調益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為主[8]。針對病毒性心肌炎采用中西醫(yī)結合治療，是目前臨床較為理想的治療方案。相關研究顯示，純中藥制劑參麥注射液可改善心功能，顯著提高慢性心力衰竭及病毒性心肌炎病人臨床療效，已廣泛運用于臨床[6，9]，但具體機制還有待闡明。

研究顯示，CVB3除了可引起心肌細胞但直接損傷外，還可激活持續(xù)性炎癥反應，促進心肌細胞凋亡甚至壞死，而持續(xù)性的炎癥反應與機體自噬系統(tǒng)的激活密切相關，在病毒感染過程中，病毒利用自噬逃避降解，促進病毒復制和釋放，同時病毒感染后，細胞膜產生重組，增加雙層膜囊泡的數量[10]。自噬體的雙層膜結構為病毒復制提供了平臺，并保護其免受天然免疫系統(tǒng)的識別和降解。此外，CVB3可在受感染的心肌細胞中復制，除了心肌細胞以外，也可感染心臟成纖維細胞，并且其復制能力比在心肌細胞中更高[11]。病毒感染激活的自噬會促進炎癥反應，使用CVB3刺激心肌細胞和心臟成纖維細胞，導致炎性因子的產生和釋放增加，從而加重心肌炎的進展[12]。抑制過度的自噬可以有效減少炎性因子的合成與釋放[13]。因此，在病毒感染階段，抑制自噬可有效抑制病毒復制，減少心肌細胞的凋亡與壞死。參麥注射液主要由紅參合和麥冬組成，具有滋陰補氣、養(yǎng)陰生津之功效。研究表明，參麥注射液可顯著改善慢性心力衰竭病人心肌能量代謝，降低炎癥反應，改善心功能[14]。本研究結果顯示，參麥注射液可顯著抑制病毒性心肌炎病人過度的自噬水平和細胞凋亡，主要表現為使自噬相關基因(Beclin-1、LC3-Ⅱ)和細胞凋亡相關基因(Caspase-3)表達水平明顯降低。研究證實，過度的自噬可誘發(fā)細胞凋亡，線粒體依賴性途徑是細胞凋亡的重要機制，自噬通過對線粒體的大量降解，抑制了機體能量代謝，促進了細胞凋亡及相關促炎細胞因子的分泌[15]。在本研究中，參麥注射液可顯著降低病毒性心肌炎病人炎癥水平，即IL-6和TNF-α水平，其可能與抑制過度的自噬有關。心功能指標的變化可有效反映病毒性心肌炎病人臨床治療效果及預后，本研究結果顯示，參麥注射液可顯著改善心功能指標如LVEF水平顯著升高，而LVEDD和LVESD水平顯著降低(P<0.05)。觀察組病人不良反應發(fā)生情況與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。少數出現不良反應的病人，癥狀較輕，未經特殊處理癥狀均自行消失，提示參麥注射液在改善急性病毒性心肌炎病人臨床治療效果的同時，并未增加相關不良反應的發(fā)生率。參麥注射液通過抑制病毒性心肌炎病人機體自噬和凋亡水平，有助于降低炎癥反應、改善心功能，但是否可進一步改善其預后水平，還需進一步研究。

綜上所述，參麥注射液治療病毒性心肌炎效果確切，其可降低外周血單核細胞自噬及凋亡水平，抑制炎癥反應的持續(xù)放大，從而改善心功能。但鑒于本研究存在一定局限性①參麥注射液如何調控自噬的分子機制尚不清楚，還需要動物及細胞實驗進一步研究；②本研究樣本量偏少，同時也是單中心研究，希望下一步加大樣本量，采取多中心研究予以證實上述研究結果。