菌株Trameteshirsutazlh237發(fā)酵液對污染土壤中多環(huán)芳烴的降解及群落結(jié)構(gòu)分析

甄靜　李冠杰　杜志敏　王繼雯　楊文玲　鞏濤　趙俊杰

摘要：【目的】利用中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離獲得的菌株Trametes hirsuta zlh237，研究生物強(qiáng)化（接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液）對污染土壤中3種多環(huán)芳烴（PAHs）[Phenanthrene、Pyrene和Benzo[a]pyrene（BaP）]的降解效果，為該菌株在PAHs污染土壤中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā坎捎酶咝б合嗌V（HPLC）檢測7個(gè)處理土壤（接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液的Phenanthrene、Pyrene和BaP污染土壤分別標(biāo)記為PheBA、PyrBA和BaPBA，接種滅菌發(fā)酵液的污染土壤分別標(biāo)記為Phe、Pyr和BaP，原始土壤標(biāo)記為CK）中3種PAHs含量，利用ABTS法檢測土壤中漆酶活性，并運(yùn)用高通量測序技術(shù)分析修復(fù)后土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化。【結(jié)果】菌株T. hirsuta zlh237在3種PAHs污染土壤中均能生長，接種菌株發(fā)酵液15 d后，3種PAHs均有一定降解，其中BaP降解效果最佳，降解率達(dá)33.99%;且菌株T. hirsuta zlh237在3種污染土壤中均能分泌漆酶。高通量測序Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明，污染土壤接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液后，Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著增加（P<0.05），不同處理土壤樣品的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)排序均為：PheBA>PyrBA>BaPBA>CK>Phe>Pyr>BaP。Beta多樣性的主成分分析（PCA）結(jié)果表明，接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液能改變污染土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成;在門分類水平上，污染土壤樣品中變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢門;在屬分類水平上，接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液的污染土壤樣品中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）為優(yōu)勢菌屬，接種滅菌發(fā)酵液的污染土壤Phe和Pyr樣品中苯基桿菌屬（Phenylobacterium）為優(yōu)勢菌屬，而BaP樣品中假單胞菌屬（Pseudomonas）為優(yōu)勢菌屬?！窘Y(jié)論】菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液在PAHs污染土壤中能分泌漆酶，對3種PAHs均有一定的降解效果，且能改變污染土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，在一定程度上對PAHs污染土壤有較好的修復(fù)效果。

關(guān)鍵詞：菌株Trametes hirsuta zlh237; 發(fā)酵液;生物強(qiáng)化;多環(huán)芳烴;降解;高通量測序;群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)： S154.36? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）01-0072-08

Abstract：【Objective】Trametes hirsuta zlh237 isolated by State Key Laboratory of Mycology， Institute of microbio-logy， Chinese Academy of Sciences was used. Bioaugmentation by inoculating T. hirsuta zlh237 fermentation liquid was used to study its biodegradation effect on three kinds of polycyclic aromatic hydrocarbon（PAHs）[Phenanthrene， Pyrene and Benzo[a]pyrene（BaP）]. That provided a scientific basis for its application in PAHs contaminated soil. 【Method】The concentrations of the respective PAHs in the seven treated soil were determined by high performance liquid chromatography（HPLC） （The Phenanthrene， Pyrene and Bap contaminated soils incubated with fungal fermentation liquid were respectively labeled PheBA， PyrBA and BaPBA. The contaminated soils incubated with sterilized fungal fermentation li-quid were respectively labeled Phe，Pyr and BaP. The original soil sample with sterilized water was labeled CK）. Laccase activity was spectrophotometrically determined with ABTS. Bacterial community structures in the three PAHs-contamina-ted soils were analyzed by illumina MiSeq high-throughput sequencing. 【Result】The results showed T. hirsuta zlh237 could remain active in the PAHs-environment. T. hirsuta showed the ability to degrade three PAHs in the soil， and had best degradation effect on BaP after 15 days with the degradation rate of 33.99%， and T. hirsuta zlh237 produced laccase in three PAHs contaminated soils. Moreover， the result of illumina MiSeq high-throughput sequencing alpha diversity analysis showed that the PAHs-contaminated soil inoculating T. hirsuta fermentation liquid showed significant increases （P<0.05） in the Chao1 index and Shannon index with the descending order of PheBA>PyrBA>BaPBA>CK>Phe>Pyr>BaP. Principal component analysis（PCA） of beta diversity implied that the microbiological structures of the PAHs-contami-nated soil were restored by inoculating of T. hirsuta. At the phylum level， Proteobacteria was dominant phylum in the PAHs-contaminated soil. At the genus level，Sphingomonas was dominant genus in the PAHs-contaminated soil with inoculating T. hirsuta. Phenylobacterium was dominant genus in the Phe and Pyr contaminated soil without inoculating T. hirsuta. Pseudomonas was dominant genus in the BaP contaminated soil without inoculating T. hirsuta. 【Conclusion】T. hirsuta zlh237 fermentation liquid can release laccase in PAHs-contaminated soils， and can degrade three PAHs and change the microbiological structures of the PAHs-contaminated soil， and has certain remediation effects on PAHs-contaminated soil.

Key words： Trametes hirsuta zlh237; fermentation liquid; bioaugmentation; polycyclic aromatic hydrocarbons; biodegradation; high throughput sequencing; community structure

Foundation item：Henan Key Scientific and Technological Project（182102311032）; Research and Development Project of Henan Academy of Sciences（18ZX05003）; Basic Scientific Research Project of Henan Academy of Sciences（190605020，190605019）

0 引言

【研究意義】多環(huán)芳烴（PAHs）是一種普遍存在于陸地和水生環(huán)境中的持久性有機(jī)污染物，其污染源可分為自然源和人為源（Kaushik and Haritash，2006）。自然源主要包括森林和牧場火災(zāi)、火山爆發(fā)和樹滲出液等，由此形成的PAHs較少;而人為源是造成PAHs大量釋放的主要原因，因?yàn)镻AHs是石油和煤等的重要組成部分（Schützendübel et al.，1999）。PAHs因其強(qiáng)烈的毒性、致癌性和突變性而對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成極大危害。有研究表明，土壤承擔(dān)90%以上的PAHs負(fù)荷（彭華和王維思，2009），即土壤中的PAHs給人類健康帶來更高風(fēng)險(xiǎn)（曹云者等，2012）。土壤中PAHs可通過吸附、揮發(fā)、光解和化學(xué)等方法進(jìn)行修復(fù)，微生物修復(fù)技術(shù)因具有廉價(jià)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，已成為最具潛力的土壤修復(fù)技術(shù)。因此，近年來利用微生物修復(fù)污染土壤越來越受到廣泛關(guān)注?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在微生物修復(fù)技術(shù)中，細(xì)菌主要降解低分子量PAHs，陶佳雨等（2019）從麥冬中分離出的細(xì)菌Enterobacter sp. PRd5對低分子量萘、芴和菲（50 mg/L）的降解率可達(dá)95%，對高分子量苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene，BaP）的降解率僅有17.44%。與細(xì)菌相比，真菌對PAHs污染土壤的修復(fù)有獨(dú)特作用（潘澄等，2011;吳宇澄和林先貴，2013），其通過共同代謝作用可有效去除高分子量PAHs，田晶等（2018）篩選出的真菌菌株Aspergillus flavus AD-X-1對高環(huán)苯并蒽和二苯并蒽的降解能力分別達(dá)68%和63%。茆婷等（2012）篩選獲得一株真菌F-5，該真菌可使土壤中的BaP、二苯并（a，h）蒽等高環(huán)、高毒性多環(huán)芳烴得到降解;進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)PAHs經(jīng)微生物氧化降解后產(chǎn)生許多氧化PAHs（Oxygenated PAHs，Oxy-PAHs），其對動(dòng)、植物具有明顯的毒害作用，毒性甚至比母體毒性更強(qiáng)（Lundstedt et al.，2007），而產(chǎn)漆酶的真菌對PAHs具有獨(dú)特的氧化機(jī)制，林先貴等（2017）通過同位素示蹤發(fā)現(xiàn)，BaP經(jīng)漆酶氧化降解后，更多的是形成不可提取物，可能是漆酶作用于PAHs導(dǎo)致解毒的另一重要機(jī)制（K?stner et al.，2014）。正是由于漆酶對PAHs的特殊作用，漆酶生物修復(fù)方法成為PAHs污染土壤修復(fù)技術(shù)的重要發(fā)展方向。【本研究切入點(diǎn)】目前，關(guān)注的焦點(diǎn)集中在微生物對PAHs降解效果及降解機(jī)理的研究，但很少關(guān)注降解后土壤是否獲得良好的修復(fù)效果，因?yàn)槿魏涡迯?fù)過程的最終目的不僅僅是去除土壤中的污染物，更重要的是能恢復(fù)土壤的潛在功能（Labud et al.，2007;Epelde et al.，2009）?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過生物強(qiáng)化方法添加產(chǎn)漆酶菌株Trametes hirsuta zlh237的發(fā)酵液，分析其對污染土壤中3種PAHs的降解效果，同時(shí)采用高通量測序技術(shù)檢測土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，旨在評價(jià)產(chǎn)漆酶菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液對污染土壤的修復(fù)效果，為該菌株在PAHs污染土壤中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 菌株和試劑 菌株T. hirsuta zlh237從中國科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏并提供的真菌中篩選獲得。Phenanthrene、Pyrene和BaP 3種試劑為Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)品。

1. 1. 2 培養(yǎng)基和發(fā)酵液 液體發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：NaH2PO4·12H2O 0.390 g，MgSO4·7H2O 0.500 g，C4H4Na2O4 1.180 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0315 g，CaCl2·2H2O 0.100 g，MnSO4·H2O 0.035 g，CH3COONa·3H2O 0.408 g，CoCl2·6H2O 0.060 g，ZnSO4·7H2O 0.028 g，CuSO4·5H2O 0.168 g，玉米粉40.000 g，C4H12N2O6 3.000 g，Tween-80 0.025 mL，維生素B1 10 ?g，維生素B2 5 μg，維生素B6 5 μg，pH自然。分裝50 mL到250 mL三角瓶內(nèi)，121 ℃滅菌25 min備用。

發(fā)酵液制備：將PDA培養(yǎng)基上生長的菌株T. hirsuta zlh237接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 d后備用。

1. 2 T. hirsuta zlh237發(fā)酵液對土壤中PAHs的降解

供試土壤采自鄭州市郊區(qū)農(nóng)田，土壤中不含PAHs，將采集的土壤自然風(fēng)干過篩后準(zhǔn)確稱取300.00 g，分別與Phenanthrene、Pyrene和BaP混合均勻，制備成標(biāo)準(zhǔn)濃度的Phenanthrene、Pyrene和BaP污染土壤，使Phenanthrene、Pyrene和BaP終濃度均為50 mg/kg，將制備的3種污染土壤分別置于直徑15 cm的花盆中。取25 mL T. hirsuta zlh237發(fā)酵液接種至Phenanthrene、Pyrene和BaP污染土壤中，分別標(biāo)記為PheBA、PyrBA和BaPBA，其中發(fā)酵液中漆酶活性為15.93 U/mL，菌體干重為56.4 mg/mL。對照組土壤加入25 mL滅菌發(fā)酵液，接入滅菌發(fā)酵液的污染土壤分別標(biāo)記為Phe、Pyr和BaP，原始土壤標(biāo)記為CK，共7個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。7個(gè)處理的土壤在30 ℃下黑暗培養(yǎng)15 d，保持花盆中土壤水含量為60%。

1. 3 土壤中漆酶活性分析

每隔5 d檢測土壤中漆酶活性1次。每處理取1.00 g土壤放入5 mL試管中，加入蒸餾水1 mL，旋渦振蕩10 min后，于25 ℃、180 r/min搖床上振蕩20 min，離心取上清液測定其漆酶活性。漆酶活性采用ABTS法檢測。

1. 4 土壤中PAHs萃取和高效液相色譜（HPLC）分析

采用安捷倫LC-1200型高效液相色譜儀測定土壤中PAHs含量。將處理15 d后的土壤從花盆中取出并混勻，每處理取5.00 g土樣，加入色譜純正己烷，并采用索氏萃取法（Teng et al.，2010）進(jìn)行萃取，萃取液用于HPLC檢測。樣品注入量20 μL，分離柱為ZORBAX SB-C18 Column[0.46 mm×150 mm，安捷倫科技（中國）有限公司]，柱溫30 ℃，紫外檢測波長254 nm，流動(dòng)相為乙腈和水（v∶v=80%∶20%），流速1.0 mL/min。

1. 5 高通量測序分析

土樣送至北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增，Illumina MiSeq-PE300高通量平臺(tái)測序結(jié)果利用QIIME進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析（Caporaso et al.，2010）。首先將獲得的Raw_Tags經(jīng)進(jìn)一步去除嵌合體、短序列后得到優(yōu)質(zhì)序列Clean_Tags，用Usearch按照97%相似性序列進(jìn)行OTU聚類（不含單序列），得到代表序列后再將其全部序列按照97%相似度Map到OTU上形成OTU列表，獲得每處理樣品OTU中的豐度信息，OTU相對豐度初步反映樣品的物種豐富信息。使用97%相似度的OTU，利用Mothur作稀釋性曲線分析（Amato et al.，2013），并利用QIIME對每個(gè)樣品進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析，包括Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，用R軟件對每個(gè)樣品在門和屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)柱形圖進(jìn)行繪制，并進(jìn)行Beta多樣性分析[Principal component analysis（PCA），主成分分析]，比較各樣品間的菌群結(jié)構(gòu)差異。

2 結(jié)果與分析

2. 1 菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液對土壤中PAHs的降解效果

由圖1可知，菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液處理PAHs污染土壤15 d后，對Phenanthrene、Pyrene和BaP均有一定的降解效果，其中Phenanthrene的降解率為39.37%，Pyrene降解率為34.00%，BaP降解率為33.99%。與CK和滅菌發(fā)酵液相比，菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液對Pyrene和BaP的降解效果均達(dá)顯著差異水平（P<0.05，下同）;而對Phenanthrene的降解率與滅菌發(fā)酵液間無顯著差異（P>0.05），與CK間達(dá)顯著差異水平。在3種PAHs污染土壤中，菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液對BaP的降解效果最佳。

2. 2 土壤中漆酶活性測定結(jié)果

從圖2可看出，在3種PAHs污染土壤中，漆酶活性均隨處理時(shí)間的延長呈先升后降的變化趨勢，以Pyrene污染土壤中的漆酶活性最高，在第10 d時(shí)漆酶活性為6.40 U/g，其次為BaP污染土壤，其最高漆酶活性為4.08 U/g（第10 d）。3種污染土壤中的漆酶活性存在顯著差異。

2. 3 土壤樣品測序及Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果

對土壤樣品中細(xì)菌16S rRNA序列的V3～V4進(jìn)行高通量測序分析，7個(gè)樣品共獲得最終用于后續(xù)分析的有效序列總數(shù)為184558條，將其全部序列按照97%相似度map到OTU上形成OTU列表，7個(gè)樣品中共獲得9256條OTUs，其中優(yōu)質(zhì)序列的長度分布在420～480 bp（表1）。

土壤樣品細(xì)菌群落的Alpha多樣性分析可反映微生物群落的豐富度和多樣性，其中Chao1指數(shù)側(cè)重于體現(xiàn)群落的豐富度，用以估計(jì)群落中OTU數(shù)目，Chao1指數(shù)越大，說明細(xì)菌群落的豐富度越大;Shannon指數(shù)用來估算樣品中微生物群落的多樣性，Shannon指數(shù)越大，說明土壤中細(xì)菌群落的多樣性越高。由表1可知，菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液修復(fù)土壤樣品（PheBA、PyrBA和BaPBA）的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于添加滅菌發(fā)酵液的土壤樣品（Phe、Pyr和BaP）和CK，而添加滅菌發(fā)酵液土壤的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著低于CK;各處理土壤樣品的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)排序均為PheBA>PyrBA>BaPBA>CK>Phe>Pyr>BaP。此外，所有土壤樣品的測序文庫覆蓋率均在95%以上，說明測序分析結(jié)果能充分體現(xiàn)土壤中絕大多數(shù)細(xì)菌群落信息，測序結(jié)果具有很好的代表性。

2. 4 土壤樣品的細(xì)菌群落組成分析結(jié)果

2. 4. 1 在門分類水平上的細(xì)菌群落分析 所有處理土壤樣品在門分類水平上的細(xì)菌群落組成如圖3所示。7個(gè)處理土壤共獲得11個(gè)門和未確定類群，其中11個(gè)門分別為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和Parcubacteria。在CK中，放線菌門的相對豐度最高，為57.70%;而其他處理土壤樣品中變形菌門的相對豐度均最高，為35.83%～84.45%。在接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液的土壤中，優(yōu)勢菌群為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門，其中變形菌門的相對豐度在36.45%～52.20%，放線菌門和酸桿菌門的相對豐度分別在17.07%～35.49%和11.22%～11.62%。在接種滅菌發(fā)酵液的土壤中，Pyr土壤中厚壁菌門為第二優(yōu)勢門，相對豐度為18.96%，Phe和BaP土壤中擬桿菌門為第二優(yōu)勢門，相對豐度分別為17.10%和6.97%，僅次于變形菌門。

2. 4. 2 在屬分類水平上的細(xì)菌群落分析 在屬分類水平上，各處理土壤主要包含41個(gè)屬（圖4），在CK中細(xì)菌（相對豐度>1.00%）主要由鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、Skermanella、芽球菌屬（Blastococcus）、Roseiflexus、Gaiella、Solirubrobacter、海洋放線菌屬（Rubrobacter）、微枝形桿菌屬（Microvirga）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、 Pseudarthrobacter、Asanoa和芽殖球菌屬（Blastococcus）組成，其中海洋放線菌屬的相對豐度最高，為7.88%。在添加滅菌發(fā)酵液土壤（Phe和Pyr）中，相對豐度最高的屬為苯基桿菌屬（Phenylobacterium），相對豐度分別為7.44%和6.45%，而在菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液修復(fù)土壤（PheBA和PyrBA）中，細(xì)菌相對豐度分布發(fā)生明顯變化，鞘氨醇單胞菌屬是其最優(yōu)勢菌屬，相對豐度分別為5.25%和5.27%，說明Phe和Pyr污染土壤中添加菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液對土壤菌群結(jié)構(gòu)有一定影響。菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液修復(fù)土壤（BaPBA）中的細(xì)菌（相對豐度>1.00%）主要由鞘氨醇單胞菌屬、RB41、Skermanella、芽球菌屬、Gaiella、Solirubrobacter、海洋放線菌屬、微枝形桿菌屬、鏈霉菌屬、Pseudarthrobacter和類諾卡氏菌屬（Nocardioides）組成，其中鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度最高，為8.51%，而添加滅菌發(fā)酵液土壤（BaP）中，細(xì)菌豐度最高的屬為假單胞菌屬（Pseudomonas），相對豐度為19.17%。

2. 5 土壤細(xì)菌群落Beta多樣性分析結(jié)果

將所有土壤樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，發(fā)現(xiàn)菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液的添加對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。由圖5可知，各土壤樣品的3個(gè)重復(fù)樣點(diǎn)均聚類于同一象限，說明樣品組內(nèi)重復(fù)性較好。菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液修復(fù)土壤樣品的PheBA和PyrBA處理樣點(diǎn)聚集在第二象限，菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液修復(fù)土壤樣品BaPBA和CK處理樣點(diǎn)聚集于第三象限，添加滅菌發(fā)酵液的土壤樣品Phe和Pyr處理樣點(diǎn)聚集在第一象限，添加滅菌發(fā)酵液的土壤樣品BaP單獨(dú)聚集在第四象限，說明PheBA和PyrBA處理下土壤細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)較相似，Phe和Pyr處理下土壤細(xì)菌群落組成相似，BaPBA和CK處理下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似。菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液修復(fù)土壤樣品和添加滅菌發(fā)酵液的土壤樣品間有明顯的分離現(xiàn)象，細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)存在顯著差異。

根據(jù)Beta多樣性距離矩陣對各土壤樣品進(jìn)行層次聚類（Hierarchical cluatering）分析，研究不同土壤樣品的細(xì)菌群落相似性。圖6通過聚類的方式得到同樣驗(yàn)證，添加滅菌發(fā)酵液的土壤（Phe和Pyr）聚為一類，BaP樣品單獨(dú)聚為一類，而在菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液修復(fù)土壤樣品中，PheBA和PyrBA樣品聚為一類，BaPBA和CK樣品聚為一類。說明相對于添加滅菌發(fā)酵液的土壤，添加菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液使土壤群落發(fā)生明顯變化。

3 討論

生物強(qiáng)化技術(shù)被認(rèn)為是一種能提升污染土壤修復(fù)效果的有效方法（Teng et al.，2010），相對于其他物理、化學(xué)處理方法，生物強(qiáng)化是一種簡便、有效且環(huán)保的處理方法（Canet et al.，2001），生物強(qiáng)化中外源微生物接種土壤后能否發(fā)揮其降解功能受多種因素制約，菌株的存活及其對土著微生物活性的刺激程度是決定其降解效果的主要因素，外源微生物能否與降解物質(zhì)有效地接觸也決定其修復(fù)效果（Yuan et al.，2002）。本研究分析真菌菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液對Phenanthrene、Pyrene和BaP 3種PAHs的降解效果，在污染土壤中接入菌株發(fā)酵液3 d后，在土壤表面能觀察到菌絲體生成，說明菌株能在污染土壤中存活并生長，可與本土微生物共存。菌株T. hirsuta zlh237是一種白腐菌，能產(chǎn)細(xì)胞外木質(zhì)素酶類，已有研究表明這些產(chǎn)胞外木質(zhì)素酶的白腐菌能有效降解PAHs，甚至比細(xì)菌具有更好的降解效果（Davis et al.，1993;Cajthaml et al.，2001）。本研究中，在CK和添加滅菌發(fā)酵液的土壤樣品中，土壤的土著微生物對3種PAHs也有一定的降解效果，但添加菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液后，該發(fā)酵液對3種PAHs的降解效果相對于土壤中土著微生物的降解效果明顯增強(qiáng)，菌株發(fā)酵液處理污染土壤15 d后，對Phenanthrene、Pyrene和BaP的降解率分別達(dá)39.37%、34.00%和33.99%，在3種PAHs中，菌株發(fā)酵液對BaP降解的促進(jìn)作用最明顯，可能與漆酶能優(yōu)先轉(zhuǎn)化BaP有關(guān)（Li et al.，2010）。土壤漆酶活性分析結(jié)果表明，接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液的3種PAHs污染土壤均具有漆酶活性，且均呈先升后降的變化趨勢，說明接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液后，菌株能在污染土壤中存活且分泌漆酶。

本研究通過Illumina MiSeq-PE300高通量測序技術(shù)對7個(gè)處理土樣進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，考察污染土壤接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液后對土壤中細(xì)菌菌群多樣性和結(jié)構(gòu)組成的影響，結(jié)果顯示，污染土壤接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液后土壤中細(xì)菌菌群多樣性和結(jié)構(gòu)組成發(fā)生顯著變化，Alpha多樣性指數(shù)中的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著增加，表明外源微生物的添加可提高土壤中細(xì)菌菌群多樣性，污染土壤得到一定修復(fù)。PCA分析是一種對數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化分析的技術(shù)，通過運(yùn)用方差分解，分析不同土壤樣品OTU（97%相似性）組成，可反映樣品間的差異和距離，并將不同土壤樣品數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上?；赑CA分析的土壤細(xì)菌群落Beta多樣性分析結(jié)果表明，接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液的土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分布緊湊且聚集在一起，添加滅菌發(fā)酵液的土壤樣品聚集在一起，說明接種外源菌株能改變污染土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，與王立紅等（2017）的研究結(jié)論相似。本研究還發(fā)現(xiàn)添加菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液的BaPBA處理土壤樣品與CK處理聚集在一處，二者群落結(jié)構(gòu)相似。

通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)，所有處理樣品在門和屬分類水平上均具有豐富的細(xì)菌群落，但接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液的土壤和接種滅菌發(fā)酵液的土壤，其檢測到的群落結(jié)構(gòu)在屬分類水平上有明顯差異。在門分類水平上，除原始土壤CK外，其他處理土壤樣品的最優(yōu)勢門均為變形菌門，黃星云等（2017）在菲降解菌群富集時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)變形菌門為最大的優(yōu)勢門。在屬分類水平上，接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液的BaPBA處理土壤中鞘氨醇單胞菌屬為細(xì)菌菌群相對豐度最高的屬，該屬是一類新型的微生物資源，可用于芳香化合物的生物降解，且已證實(shí)其對低環(huán)和高環(huán)PAHs均有很好的降解作用（Janbandhu and Fulekar，2011）。鞘氨醇單胞菌屬在PheBA、PyrBA和BaPBA土壤樣品中分別占5.25%、5.27%和8.51%，而在原始土壤CK中占2.85%，在Pyr土壤中僅占1.19%，在Phe和BaP土壤樣品中未檢測到。在接種滅菌發(fā)酵液的Phe和Pyr樣品中，苯基桿菌屬為優(yōu)勢屬，相對豐度分別為7.44%和6.45%，而BaP樣品中的優(yōu)勢屬為假單胞菌屬，相對豐度為19.17%;已有研究報(bào)道指出苯基桿菌屬（范瑞娟等，2017）和假單胞菌屬（Kuppusamy et al.，2016）在石油烴的降解中具有很好的去除作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，接種滅菌發(fā)酵液的污染土壤中PAHs降解菌屬在種類和占有比例上均高于接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液的污染土壤，但微生物群落多樣性較低，究其原因可能是在高濃度PAHs污染脅迫下，土壤中耐性差的微生物不能適應(yīng)環(huán)境而無法生存，從而致使微生物多樣性降低，僅有部分耐PAHs強(qiáng)的菌株存活下來，并成為土壤中的優(yōu)勢菌，當(dāng)土壤接種菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液后，土壤中的一部分PAHs被降解，其濃度降低，土壤得到一定的修復(fù)，導(dǎo)致土壤中PAHs降解菌屬在種類和占有比例上下降，微生物群落菌屬分布均勻，群落多樣性升高，與Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果一致。綜上所述，菌株T. hirsuta zlh237在一定程度上對PAHs污染土壤有較好的修復(fù)效果。

4 結(jié)論

菌株T. hirsuta zlh237的發(fā)酵液在Phe、Pyr和BaP污染土壤中能分泌漆酶，對3種PAHs均有一定的降解效果，尤其對Pyr和BaP具有顯著的降解效果，且該菌株發(fā)酵液能改變污染土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，提高土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，因此施用產(chǎn)漆酶菌株T. hirsuta zlh237發(fā)酵液在一定程度上能修復(fù)和改善PAHs污染土壤。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）