納米Au/核酸適配體/硅量子點熒光傳感體系用于黃曲霉毒素B1分析檢測

易守軍 黎 燕 張 敏 何 盼 趙 敏 唐春然 曾云龍*

(1.湖南科技大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，理論有機和功能分子教育部重點實驗室，精細(xì)聚合物可控制備與功能應(yīng)用湖南省重點實驗室湖南湘潭 411201；2.湖南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院湖南湘潭 411201)

量子點(QDs)具有優(yōu)異的光學(xué)、電學(xué)特性和優(yōu)良的生物相容性，在化學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、成像技術(shù)和化學(xué)生物傳感領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[1，2]。早期研究的QDs主要由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的納米晶[2]，但在制備與應(yīng)用過程中存在環(huán)境生物毒性風(fēng)險。為了解決這些不足，科技工作者研發(fā)了許多新型QDs[3，4]，SiQDs就是其中的一類[5]。SiQDs具有優(yōu)異的光電特性，且制備方法簡單，環(huán)境友好，非常適于構(gòu)建化學(xué)生物傳感檢測平臺[6，7]。然而，SiQDs在化學(xué)生物傳感中的應(yīng)用研究還不夠，尤其是在生物毒素檢測方面的研究更少。

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AF B1)具有強毒性，是已知的最強致癌物之一[8，9]。產(chǎn)生黃曲霉毒素的黃曲霉和寄生曲霉廣泛存在于土壤、灰塵、植物及其果實中，受其污染的植物與果實會留下其代謝物黃曲霉毒素，這也是AF B1引發(fā)食品安全的原因之一。因此，對食品與藥品中AF B1的監(jiān)測非常必要。目前檢測AF B1的方法主要有色譜/質(zhì)譜法、高效液相色譜法、免疫法等[10-12]。但這些方法通常存在需要昂貴的儀器設(shè)備，技術(shù)要求高，所用試劑非常容易失活，分析成本高等不足。核酸適配體(Aptamer)具有高特異性識別與結(jié)合功能，使待測試樣的處理大為簡化，與抗原/抗體等試劑相比，核酸適配體穩(wěn)定性高、成本低廉，因此，被廣泛地用于食品藥品分析、環(huán)境檢測、藥物篩選等領(lǐng)域[13-15]。本工作擬以咪唑基水溶性SiQDs為熒光探針，發(fā)展新型高靈敏度、高選擇性AF B1生物傳感檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301型熒光分光光度計(日本，島津)；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FHS-2A型可調(diào)高速勻質(zhì)機(策途精密機械上海有限公司)。

黃曲霉毒素B1(AF B1)、黃曲霉毒素B2(AF B2)、黃曲霉毒素G1(AF G1)、赭曲霉毒素A(OTA)、伏馬毒素B1(F B1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)。對AF B1具有特異性響應(yīng)的巰基修飾的寡核苷酸序列(OLN)：HS-AAA AAA GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA[13]由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。三甲基硅咪唑、檸檬酸三鈉、HAuCl4、NaH2PO4、K2HPO4、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)等均為分析純(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，其它試劑均為分析純。2.7 nmol/L Au納米粒子(AuNPs)按文獻(xiàn)方法[16]制備，其濃度按文獻(xiàn)方法[17]測得。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 水溶性SiQDs的制備水溶性SiQDs按文獻(xiàn)方法[7]合成。將1.0 g檸檬酸三鈉溶于27 mL水，快速攪拌下滴加6.7 mL三甲基硅咪唑，于室溫下避光繼續(xù)攪拌30 min，然后轉(zhuǎn)入高壓反應(yīng)釜，在220 ℃下反應(yīng)2 h，讓其在空氣中自然冷卻至室溫，將水熱反應(yīng)制備的溶液置于1 kDa透析袋中透析除去大顆粒雜質(zhì)，即得到SiQDs分散液，置于4 ℃儲存?zhèn)溆?。臨用時，取此儲備液用水稀釋20倍。

1.2.2 AuNPs/寡核苷酸/SiQDs復(fù)合物制備按文獻(xiàn)方法[18]，將巰基修飾的OLN經(jīng)TCEP活化，然后加入AuNPs，搖勻，再用pH=3.0 的0.5 mol/L酒石酸-HCl緩沖溶液稀釋，孵化30 min后，離心，棄去離心液，再用pH=5.5的10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗沉淀，離心分離，如此三次后，將沉淀分散至水中，得到AuNPs/OLN分散液。向AuNPs/OLN分散液中加入SiQDs溶液，再加入pH=5.5的PBS(10 mmol/L)，搖勻，靜置反應(yīng)10 min，即得AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物，離心沉降，棄去離心液，沉淀用pH=5.5 PBS洗滌3次，離心，除去離心液，制得AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物。將所制備的AuNPs/OLN/SiQDs超聲分散于pH=7.5 PBS中，即得AuNPs/OLN/SiQDs分散液，備用。

1.2.3 AF B1分析取AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物分散液，向該分散溶液中加入不同濃度AF B1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，混勻反應(yīng)5 min，離心分離(12 000 r/min，15 min)，取上層離心液，分別測定它們的熒光強度。按同樣的方法，向AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物中加入其它真菌毒素(AF B2、AF G1、F B1、DON、OTB和ZEN)，進(jìn)行AF B1復(fù)合物傳感體系的選擇性試驗，控制AF B1 的濃度為0.5 ng/mL，其它真菌毒素的濃度均為10 ng/mL。以上實驗均以360 nm為激發(fā)波長，測定熒光發(fā)射光譜(最大發(fā)射波長為442 nm)。光譜測定都在室溫下于10 mmol/L PBS(pH=7.5)中進(jìn)行。所得數(shù)據(jù)均為三次測定平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法原理

在本工作中，先將巰基修飾的OLN與AuNPs通過自組裝，形成AuNPs/OLN，由于AuNPs和OLN都帶負(fù)電荷，形成的AuNPs/OLN也帶負(fù)電荷；表面帶咪唑基團(tuán)的SiQDs帶正電荷，將該SiQDs加進(jìn)AuNPs/OLN體系后，AuNPs/OLN與SiQDs通過靜電自組裝形成AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物，復(fù)合物中SiQDs表面的正電荷被中和，AuNPs具有強烈猝滅QDs熒光特性[19]。因此，處于復(fù)合物中的SiQDs受AuNPs和外部電荷變化的共同作用，其熒光猝滅。向AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物溶液體系中加入AF B1時，AF B1與復(fù)合物中的OLN發(fā)生特異性反應(yīng)，生成AuNPs/OLN/AF B1并釋放出SiQDs，釋放出來的SiQDs的環(huán)境得以恢復(fù)，同時也擺脫了AuNPs的影響，其熒光得到恢復(fù)。SiQDs熒光光譜圖和AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物熒光猝滅與恢復(fù)的熒光光譜見圖1。在AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物溶液體系中加入不同濃度AF B1，測定其所對應(yīng)的熒光強度，建立AF B1濃度與體系的熒光強度之間的關(guān)系，進(jìn)而實現(xiàn)樣品中AF B1的分析檢測。

圖1 (A)SiQDs熒光激發(fā)光譜(a)與發(fā)射光譜曲線(b)；(B)SiQDs熒光光譜(a)、SiQDs在AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物中熒光猝滅(b)和AF B1存在時熒光恢復(fù)(c)曲線Fig.1 (A)Fluorescence excitation(a) and emission(b) spectra of SiQDs;(B) Fluorescence spectrum of SiQDs(a),fluorescence quenched in AuNPs/OLN/SiQDs complex(b) and fluorescence recovered in the presence of AF B1 in the complex systems (c) of SiQDs

2.2 寡核苷酸用量的影響

研究了AuNPs/OLN復(fù)合物中OLN與AuNPs的摩爾比(OLN∶AuNPs在150～250范圍)對SiQDs熒光猝滅和恢復(fù)的影響。實驗顯示，OLN為AuNPs的150至220倍時，SiQDs的熒光猝滅隨OLN的比例增大而增強，220倍時達(dá)到最大，再增大OLN用量，熒光猝滅程度下降。向發(fā)生熒光猝滅了的體系中加入AF B1，體系的熒光恢復(fù)程度隨OLN的增大，在150～200倍范圍呈線性增強，且220倍時達(dá)到最大。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是隨著AuNPs的表面OLN增大，在AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物中，SiQDs受到更多的OLN(負(fù)電荷)的影響，引起更強的表面電性變化，使體系熒光猝滅程度更為強烈。同時，隨復(fù)合物中OLN量的增大，處于自由狀態(tài)下的SiQDs與在復(fù)合物中的SiQDs的表面電荷變化也增大、因此向復(fù)合物體系中加入AF B1后，釋放出的SiQDs的熒光恢復(fù)程度也增強。當(dāng)達(dá)到220倍時，體系的熒光猝滅和恢復(fù)都達(dá)到最大。由于AuNPs表面有限，AuNPs表面上OLN的量越大，OLN彼此間的距離越小，這不僅會阻礙SiQDs與AuNPs/OLN的結(jié)合，還會阻礙SiQDs從AuNPs/OLN/SiQDs表面脫離進(jìn)入溶液，使熒光的猝滅與恢復(fù)程度下降。故在后續(xù)實驗中選擇OLN的用量為AuNPs的220倍。

2.3 pH及鹽濃度的影響

在pH=4.0～10.0范圍，研究了pH對體系熒光恢復(fù)的影響，結(jié)果見圖2。從圖中可見，在pH=4.0～7.0時，體系熒光強度隨pH升高而顯線性增強，在pH=7.0～10.0范圍，熒光強度穩(wěn)定，改變pH，熒光強度不變。這種現(xiàn)象可能是SiQDs對H+敏感。在酸性條件下，SiQDs表面咪唑基接受質(zhì)子發(fā)生電荷傳遞，同時誘導(dǎo)SiQDs發(fā)生團(tuán)聚，引起熒光猝滅。綜合考慮，在后續(xù)實驗中，控制溶液為pH=7.5。

實驗還考察了NaCl對體系熒光的影響。結(jié)果表明NaCl濃度在50 mmol/L以下時，對體系熒光無明顯影響。

2.4 孵化時間的影響

在室溫下，考察了孵化時間對熒光恢復(fù)的影響。結(jié)果如圖3所示。從圖3可見，孵化時間5 min，體系熒光迅速恢復(fù)；繼續(xù)延遲孵化時間，體系熒光強度不再變化。說明AF B1迅速與復(fù)合物中OLN結(jié)合并釋放出SiQDs。因此，可以實現(xiàn)樣品中AF B1的快速測定。

圖2 pH對體系熒光強度的影響Fig.2 Influence of pH on fluorescence intensity of the system

圖3 孵化時間對體系熒光的影響Fig.3 Influence of incubation time on fluorescence intensity of the system

2.5 其它真菌毒素的影響

控制AF B1濃度為0.5 ng/mL，其它真菌毒素濃度為10.0 ng/mL，試驗了(AF B2)、(AF G1)、DON、F B1、OTA和ZEN等真菌毒素的影響，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物傳感對AF B1呈現(xiàn)高特異性，其它真菌毒素的存在對AF B1測定無明顯干擾。

2.6 工作曲線

在pH=7.5的PBS中，依次在AuNPs/OLN/SiQDs體系中加入AF B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，用PBS稀釋至2 mL，室溫下孵化5 min，測定體系熒光強度，結(jié)果見圖5。從圖5可見，隨著AF B1濃度增大，熒光強度迅速增強。將AuNPs/OLN/SiQDs分散體系溶液的熒光強度記為F0，將加進(jìn)不同濃度的AF B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的體系熒光強度記為F，則體系熒光恢復(fù)程度為F-F0，從圖5的插圖中可以觀察到，體系的熒光恢復(fù)程度與AF B1濃度在0.01～1.0 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為：F-F0=7.689+147.227c(c：ng/mL)，相關(guān)系數(shù)r為0.9971，方法檢出限(3σ)為8 pg/mL。

圖4 AuNPs/OLN/SiQDs復(fù)合物傳感分析的選擇性Fig.4 Selectivity of AuNPs/OLN/SiQDs sensor assayConcentration of AF B1:0.5 ng/mL,others:10.0 ng/mL.

圖5 體系熒光強度隨AF B1濃度的變化情況Fig.5 The dependence of fluorescence intensity on the concentration of AF B1Inset shows the linear relationship between the F-F0 and AF B1 concentration within the range of 0.01-1.0 ng/mL.

2.7 分析應(yīng)用

實驗所用巧克力樣品購自本地超市。稱取25.0 g巧克力和5.0 g NaCl，置于高速均質(zhì)機攪拌缸中，加入100.0 mL甲醇，1.25 mL二甲基甲酰胺，加蓋，高速均質(zhì)1 min。將均質(zhì)的樣品倒入折疊好的濾紙筒中過濾，收集濾液。取10.0 mL濾液，加10.0 mL水稀釋,用11 cm玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清,即得巧克力試液，按發(fā)展方法測定。從表1中可知，該方法測定實際樣品的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)分別為94%～106%和2.1%～3.5%。表明該傳感體系適用于巧克力中痕量AF B1的檢測。

表1 巧克力中AF B1的檢測(n=3)Table 1 Detection of AF B1 in chocolates(n=3)

3 結(jié)論

構(gòu)建了新型納米生物復(fù)合物傳感器，該傳感器對AF B1呈現(xiàn)出高靈敏和高選擇性。同時，通過變換硅量子點納米復(fù)合物中的核寡苷酸，可望檢測不同的真菌毒素，拓展了硅量子點的應(yīng)用范圍，也為檢測復(fù)雜食品體系中痕量真菌毒素提供了一種新的靈敏、準(zhǔn)確、簡易、快速的方法。