基于相關(guān)性分析的金銀花和山銀花正丁醇提取物的抗腫瘤活性譜-效關(guān)系研究

萬 丹 張水寒 沈冰冰 袁清照 蔡 萍*

(1.湖南省中醫(yī)藥研究院湖南長沙 410013；2.湖南省中藥原料質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)服務(wù)中心湖南長沙 410013；3.湖南省2011數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心湖南長沙 410013)

金銀花為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花。山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬(Loniceramacranthoides)、紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)、華南忍冬(LoniceraConfusaDC.)或黃褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)的干燥花蕾或帶初開的花，具有疏風散熱、涼血解毒的功效，其主要化學成分有咖啡?；鼘幩犷怺1]、黃酮類[2]、環(huán)烯醚萜類以及皂苷類[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明金銀花具有抗腫瘤[4]、保肝、抗炎以及抗菌[5]等多種生理活性，但對其抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)的研究較少。

本研究以金銀花和山銀花為對象，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法對它們的正丁醇提取物進行分析，并建立它們正丁醇提取物的HPLC指紋圖譜，比較主要化學成分的異同，同時對其抗腫瘤活性進行評價，采用最小二乘法計算指紋圖譜特征峰與抗腫瘤作用的關(guān)聯(lián)度。運用建立的“譜-效”相關(guān)性模型能較好地體現(xiàn)金銀花、山銀花的物質(zhì)成分與抗腫瘤活性之間的相關(guān)性，從而為闡明其抗腫瘤作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

Agilent 6530型液-質(zhì)聯(lián)用儀、Agilent Technologies 1290 Infinity型高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)；Mettler Toledo XPE105型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；Thermo Fisher-Multiskan FC酶標儀。

人乳腺癌細胞株(Mcf-7)、人子宮頸癌細胞株(Hela)、人結(jié)腸癌細胞株(Ht29)均購自中科院上海細胞生物研究所；灰氈毛忍冬皂苷乙(批號：111814-201604)、川續(xù)斷皂苷乙(批號：111813-201403)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；乙醇、正丁醇均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；乙腈(色譜純，德國默克化工技術(shù)有限公司)。

4批藥材經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院劉浩助理研究員鑒定為:灰氈毛忍冬(Loniceramacranthoides,湖南隆回)、紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.,廣西都安)、黃褐毛忍冬(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng,廣西隆林)、忍冬(LonicerajaponicaThunb.,河南封丘)。

1.2 實驗方法

1.2.1 正丁醇提取物的制備稱取已粉碎的4個樣品各200 g，以料液比1∶8 加入70%乙醇，于70 ℃回流提取1.5 h，提取3次，過濾，合并提取液，濃縮干燥后得醇提浸膏。將該浸膏加水分散至質(zhì)量濃度為0.5 g/mL，加入正丁醇∶浸膏分散液=1∶1(V/V)萃取3次，移出正定醇層，蒸干，加少量水溶解，冷凍干燥，即得。

1.2.2 供試品溶液制備精密稱取4種正丁醇提取物，加甲醇溶解并定容后，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，進行HPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

1.2.3 對照品溶液配制取灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙對照品適量，加入甲醇，分別配制成濃度為0.1 μg/mL的對照品溶液。

1.2.4 HPLC-MS/MS條件采用InertSustain-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，以0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)作為流動相，采用梯度洗脫模式：0～10 min，7%～11.5%B；10～12 min，11.5%～20%B；12～30 min，20%～29%B；30～45 min，29%～31%B；45～48 min，31%～45%B。流速：1 mL/min，柱溫：30 ℃，紫外檢測波長：207 nm，進樣量：10 μL。質(zhì)譜采用電噴霧電離，正、負離子(ESI+、ESI-)模式，掃描范圍m/z100～1 800。掃描方式：全掃描和選擇離子掃描，霧化氣溫度：320 ℃，干燥氣流速：8 L/min，鞘氣(N2)溫度：320 ℃，鞘氣流速：11 L/min，碎裂電壓：185 V。

1.2.5 體外抗腫瘤活性實驗取提取物和對照抗腫瘤藥順鉑，用DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)分別配成不同濃度的供試液，取對數(shù)生長期的Mcf-7、Hela、Ht29，消化制成單細胞懸液，調(diào)整濃度為2.0×104cell/mL，每孔100 μL細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中。隔夜培養(yǎng)后加入供試液。培養(yǎng)48 h后，每孔加入0.5 mg/mL噻唑藍(MTT)工作液20 μL，孵育4 h，去除上清后，加入150 μL/hole二甲基亞砜(DMSO)，于旋渦振蕩器上振蕩10 min充分溶解結(jié)晶。然后在酶標儀上，于570 nm波長處測定每孔的吸光度值(OD)。細胞增殖抑制率=(對照組OD值-藥物組OD值)/對照組OD值×100%。依次計算藥物對癌細胞的半數(shù)抑制濃度(Ic50)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜峰的歸屬[6-10]

按照1.2.2方法制備得到樣本，采用HPLC-MS/MS法進行分析檢測，以正、負離子掃描方式采集質(zhì)譜信息，ESI-模式下的總離子流色譜圖見圖1。對其特征峰進行定性分析，結(jié)合對照品和文獻信息共鑒定出31個化合物(表1)。

圖1 各提取物ESI-模式的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of each extracts in ESI- modea.Lonicera hypoglauca Miq.;b.Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng;c.Lonicera macranthoides Hand.-Mazz;d.Lonicera japonica Thunb..

表1 各提取物的化學成分鑒定Table 1 Identification of chemical constituents of each extracts

+:detected.

2.2 體外抗腫瘤活性

按照1.2.5項進行各樣品的體外抗腫瘤活性測試，Mcf-7、Hela、Ht29三個細胞株的結(jié)果見表2。由表2可知，各樣品有一定的抗腫瘤活性，其中紅腺忍冬對Mcf-7的效果與藥物順鉑相當。

表2 各提取物對三種人體腫瘤細胞株的抑制作用(Ic50)Table 2 Growth inhibition of each extract against three human tumor cell lines(Ic50)

2.3 正丁醇提取物指紋圖譜與抗腫瘤活性的相關(guān)性分析[11 - 13]

對4個樣品在3個不同濃度(100 μg/mL、50 μg/mL、1 μg/mL，構(gòu)建為矩陣X)的抗腫瘤活性進行測試，分別得到不同濃度下的活性值(構(gòu)建為活性矩陣Y)。結(jié)果表明：Mcf-7和Ht29細胞系實驗中抗腫瘤活性之間存在明顯的相關(guān)性，擬合相關(guān)系數(shù)(R2)分別達到了0.9681和0.9673，說明樣品的物質(zhì)成分與抗腫瘤活性之間存在明顯的相關(guān)性。以實驗結(jié)果與擬合的結(jié)果分別為橫坐標和縱坐標作圖，得到圖2和圖3。在建立擬合模型的過程中，得到每個物質(zhì)的擬合系數(shù)，從而明確每個物質(zhì)對抗腫瘤活性貢獻度。從圖4中可見，峰8(斷氧化馬錢子苷)、峰20(3,4-二咖啡?？鼘幩?、峰29(川續(xù)斷皂苷乙)等具有較高的抗腫瘤活性貢獻度，是其抗腫瘤活性的主要來源。有研究發(fā)現(xiàn)3,4-二咖啡酰奎寧酸能抑制MCF-7的生長和增殖，誘導(dǎo)MCF-7發(fā)生凋亡，這與本實驗中發(fā)現(xiàn)3,4-二咖啡?？鼘幩峋哂锌鼓[瘤活性結(jié)論一致。

圖2 各物質(zhì)與Mcf-7細胞株活性最小二乘擬合結(jié)果Fig 2 The fitting results obtained by using active substances and Mcf-7 cell line

圖3 各物質(zhì)與Ht29細胞株活性最小二乘擬合結(jié)果Fig 3 The fitting results obtained by using active substances and Ht29 cell line

圖4 各物質(zhì)對抗腫瘤活性的重要度Fig 4 The variable importance of each substance

3 結(jié)論

本實驗采用液-質(zhì)聯(lián)用分析金銀花和山銀花正丁醇提取物的抗腫瘤活性，通過分析化學成分與藥效活性的相關(guān)性，從中篩選出具有代表性的化合物，這對金銀花和山銀花的抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)的進一步研究具有重要意義。